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CDPKs(calcium-dependent and calmodulin-independent protein kinases),全称依赖钙而不依赖钙调素的蛋白激酶,是一类仅在植物和部分原生生物中存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在介导植物生长发育信号和逆境信号转导中具有重要作用。目前在水稻中已发现31个CDPKs基因,但功能明确的只有少数几个基因,其它大多数基因的功能有待进一步研究。本项研究是针对Os CDPK12和Os CDPK24两个基因开展的。本研究获得的主要研究结果如下:1.Os CDPK12的启动子分析1.1通过PCR技术从日本晴(Oryza sativa L ssp.Japonica)基因组上克隆到Os CDPK12上游2109 bp的启动子区域,命名为12P,将其融合报告基因β-glucuronidas(GUS),转化水稻中花11(Oryza sativa L ssp.Japonica),组织化学染色结果显示主要在根茎过渡区、茎节、花药、种子中表达;之后对该启动子进行5’端缺失分析,构建8个融合报告基因GUS的缺失载体,对其转基因水稻植株的研究发现,除12P687外,各个缺失启动子均能驱动GUS基因在根茎过渡区、幼穗花药、枝梗、茎节、种子中表达,而在叶、叶鞘和根中不表达,12P687却能驱动GUS基因在各个组织中表达,表现为组成型表达的特征。1.2对比分析不同缺失启动子转基因植株各组织的染色结果,可以看出,在-966 bp~-687 bp区域,存在关键的负调控元件;-687 bp~-472 bp区域,具有正向调控的顺式作用元件。1.3 GUS活性的定量测定结果显示,12P687启动子在叶和叶鞘组织中的活性约为35S启动子活性的1/2,而根中12P687启动子的活性约为35S启动子活性的1/3。1.4对不同缺失启动子的转基因植株进行了低温、低氮和高盐胁迫处理,发现12P1828的转基因材料经冷胁迫后在叶片中表达上升,而12P687的转基因材料经高盐胁迫后在根中表达下降。2.水稻CDPKs与GRXs的蛋白互作研究2.1克隆了水稻GRXs的22个基因,分别是:Os GRX3、Os GRX4、Os GRX5、Os GRX6、Os GRX8、Os GRX9、Os GRX11、Os GRX12、Os GRX14、Os GRX15、Os GRX16、Os GRX17、Os GRX19、Os GRX20、Os GRX21、Os GRX22、Os GRX24、Os GRX25、Os GRX26、Os GRX27、Os GRX28、Os GRX29。并将其分别构建到AD载体上,获得22个重组载体。通过自激活检测,发现均无潜在激活基因转录活性。2.2 Os CDPK24与水稻GRXs的蛋白互作验证结果表明Os GRX8、Os GRX16、Os GRX26、Os GRX28分别与Os CDPK24-1的蛋白是有互作的,而Os GRX8、Os GRX14、Os GRX16、Os GRX26、Os GRX28分别与Os CDPK24-2的蛋白也是互作的。2.3分别克隆水稻CDPKs序列Os CDPK2、Os CDPK20、Os CDPK21、Os CDPK23、Os CDPK25、Os CDPK29全长序列及截短序列。并将其分别构建到BD载体上获得重组载体。通过自激活检测,发现除Os CDPK23-1外均无潜在激活基因转录活性。2.4水稻CDPKs与GRXs的蛋白互作验证结果表明Os CDPK4、Os CDPK12、Os CDPK20、Os CDPK21、Os CDPK25、Os CDPK29与水稻GRXs蛋白均无互作。2.5通过DNAMAN工具对Os GRX8、Os GRX14、Os GRX16、Os GRX26、Os GRX28的氨基酸序列进行了多重序列比对,结果发现这些序列并没有明显的保守区域;然而针对Os GRX8、Os GRX26、Os GRX28这3个的氨基酸序列进行多重序列比对,发现这些序列存在明显的保守区域。