稻飞虱（半翅目:飞虱科）在我国主要包括褐飞虱、灰飞虱以及白背飞虱3个优势种。3种飞虱均以直接刺吸、蛀茎产卵以及传播植物病毒的方式为害水稻等禾本科作物。由于其种群所具有的爆发性和迁飞性,在我国,3种飞虱均能常年对我国大面积的水稻生产区造成严重的损失。目前,传统的化学农药结合预测预报依然是防治稻飞虱的主要方法。化学防治带来的无法避免的环境污染、田间生态单调和野生种群抗性的问题也一直存在,因此,新型、高效、环境友好且兼具有经济上可行性的稻飞虱治理策略的发掘在过去数十年里一直是稻飞虱研究中的热点。近些年来,伴随着相关知识的增加和技术的突破,昆虫内共生菌Wolbachia因其自身所具备的特殊的生物学特性,被人们广泛关注和研究,并逐渐展示出其在害虫防治上广阔的应用潜力。本文基于昆虫胚胎显微注射技术,成功建立了褐飞虱Wolbachia人工转染品系,证实了Wolbachia在不同稻飞虱间转染且稳定遗传的可行性。同时,通过荧光原位杂交的方法,比较了新感染的wStri株系与自然感染的原生wLug株系在褐飞虱体内的组织分布情况。此外,还对新建立的转染褐飞虱虫株的经卵传递效率、胞质不亲和（cytoplasmic incompatibility,CI）水平以及适合度变化均进行了系统的评估与监测。在此基础上,在室内利用褐飞虱转染株对野生种群进行了成功的种群替换试验,并结合简易的数学模型评估了该转染株的种群替换能力。进一步对转染株的抗病毒研究发现,wStri在褐飞虱中的感染对水稻齿叶矮缩病毒（Rice ragged stunt virus,RRSV）起到一定的拮抗作用。这些研究结果打破了Wolbachia技术在稻飞虱防治中的技术壁垒,奠定了该技术在农业害虫中的应用基础,为农业害虫中的有害昆虫综合治理（Integrated Pest Management,IPM）防治领域提出了新的有应用价值的策略。1.适合稻飞虱的Wolbachia转染技术的探索与建立本研究根据稻飞虱的生殖生理学特性,基于在蚊子和果蝇中已有的转染方法,通过对注射后孵育方法的摸索与总结,成功实现了比较高效的转染实验技术的改进。在将除注射损伤以外的影响因素降至最低的情况下,保证了注射中的虫卵有大于5%的比例能够存活至孵化,并历经生长发育至成虫。雄虫直接在羽化后通过PCR检测其Wolbachia的感染情况,而雌虫则需进行交配产卵后接受检测。分别以感染wAlbA和wAlbB株系的白纹伊蚊和感染wStri株系的灰飞虱为Wolbachia菌源供体对自然不感染的褐飞虱及四环素处理后的褐飞虱进行胚胎注射,最终在从灰飞虱到褐飞虱四环素处理株的转染试验中成功地得到了唯一的褐飞虱转染株系并以此建立了实验室种群。灰飞虱源的wStri Wolbachia在转向褐飞虱时相较于与wLug在亲缘关系上均较远的白纹伊蚊源的Wolbachia亲和性更好,最终也实现了在新宿主体内成功的定殖。此外,四环素处理对于褐飞虱体内外源Wolbachia的转染也起到至关重要的作用,表明在宿主体内所存在的原生微生物组,尤其是一些共生细菌,可能对Wolbachia的侵染和在宿主组织内的迁移起到阻遏作用。在密集注射过程中还发现,除了供体菌株的差异和受体原生微生物组,供体胚胎不同位置的胞浆也会影响注射后的感染效率。对注射当代受体褐飞虱卵的孵化历期和发育历期的分析表明,注射损伤除了会直接引起胚胎死亡,同时也会导致卵孵化的滞后以及由胚胎发育畸形引起的胚胎死亡,而Wolbachia在G0当代中的感染并不会影响宿主的正常发育。研究结果验证了小型半翅目昆虫中的Wolbachia转染的可行性,以及阻碍Wolbachia与新宿主成功建立共生关系的主要生物学影响因素。上述内容对进一步研究共生菌与半翅目昆虫宿主之间的关系以及更多类似的半翅目转染株的建立提供了理论基础。2.褐飞虱Wolbachia转染株母系遗传效率、CI水平和适合度评估褐飞虱转染株成功建立后,其经卵传递效率、CI水平和适合度状况均被反复评估与监测。通过持续的PCR检测发现,10个成功感染wStri的褐飞虱单雌系均在G0-G2代表现出了几乎100%的经卵传递效率。在用作后续研究并扩大繁育种群的单雌系（命名为NLS）中,经历了连续数十代的饲养且在没有人工筛选的情况下依然稳定保持着100%的感染率。而在母系遗传的稳定性上,转染株甚至远远超过了褐飞虱野生种群中自然感染的wLug株系。荧光原位杂交定位Wolbachia以及对宿主卵巢等组织的Wolbachia定量也进一步验证了这一结论,wStri相较于wLug在宿主褐飞虱体内各组织的滴度水平以及分布范围均具有绝对的优势。这些结果表明了 wStri株系具备较强的侵染力,能够稳定地定殖于受体褐飞虱体内,且能顺利地通过经卵传递的方式扩散感染新宿主的所有后代。此外,在对褐飞虱转染株NLS的CI评估中还发现,该株系对四环素处理的褐飞虱以及自然感染的褐飞虱均表现出不完全的单向CI。进一步监测发现,该转染株系的CI水平在实验室内的连续传代过程中一直在不断发生变化,不亲和交配组的平均孵化率最终稳定在20%上下,略有波动。对其中交配后NLS雄虫的Wolbachia定量表明,雄虫个体诱导的CI水平高低与Wolbachia菌的滴度呈正相关关系。在人工筛选无法进一步优化得到可以诱导完全CI的转染株的情况下,基于X射线的昆虫绝育技术完成了对转染株所诱导的不完全CI的补偿。通过X射线辐射褐飞虱转染株雄虫发现,低剂量的X射线对CI水平的补偿能力不显著,只有达到接近完全绝育的自然种群的剂量（60 Gy）时才可以达到接近100%CI的效果。对转染株的适合度评估发现,wStri在褐飞虱中的定殖对宿主的适合度影响仅表现为一定程度上缩短了宿主的寿命,而对宿主的生殖力并没有显著的影响。这些研究结果表明了新建立的褐飞虱转染株具有很高的种群压制潜力,有助于我们以此为基础进一步对该株系在半现场以及野外进行的种群压制应用测试场景试验的设计。3.基于褐飞虱转染株的种群替换模型的建立与抗病毒能力的评估基于上述结果,我们利用褐飞虱转染株NLS表达的CI和适合度优势对野生种群进行替换测试,与此同时评估NLS株对褐飞虱所传的水稻齿叶矮缩病毒（RRSV）的抗性。在室内的养虫笼内接入不同起始比例的NLS雌虫,连续多代对笼内种群的监测表明,尽管速率有快慢,所有的笼内种群均能够实现完全的种群替换。对6%、12%、20%和40%四个笼内种群动态建立数学模型分析,其中基于98%CI水平的模拟结果基本与真实种群替换趋势一致,表明褐飞虱转染株NLS具有足够强的替换野生种群的能力。在抗病毒试验中,利用胸腔注射病毒的方法证实了 NLS体内感染的Wolbachia能显著抑制病毒在宿主体内组织的扩散和增殖,有效阻断了病毒的传播。尽管供试的两个虫株的经口饲毒感染率均不高,NLS的感毒率仍然显著低于四环素处理株NLT,表明转染株虽然不能完全阻断RRSV病毒的侵染,但是依旧具有较高的抗感染能力。进一步比较利用饲毒后的野生种群GNI和转染种群NLS分别进行水稻植株叮咬传毒实验结果发现,被饲毒后的褐飞虱转染株叮咬后的水稻植株发病率和发病症状的严重程度显著低于被自然种群所叮咬过的水稻,虫体病毒检测结果也证实了 NLS相较于GNI带毒水平和带毒率均显著降低。综上所述,结合转染褐飞虱虫株的种群替换能力以及抗病毒能力,在种群压制实施困难的情况下,以种群替换的方式来针对性地以防治褐飞虱传毒为目的的策略具备了 一定的可行性。除此之外,也为构建利用Wolbachia技术的褐飞虱种群替换模型建立了初步的理论基础。