枯草杆菌（Bacillus subtilis）是重要的重组蛋白表达系统,其具有安全性好,蛋白分泌能力强和发酵方法成熟等优点。然而,高产工程菌株的获得往往要经历长期的表达优化过程。便捷的优化方法对目标蛋白的高效表达至关重要。在枯草杆菌中目前有两种优化策略,一是通过理性设计提高转录、翻译和分泌等蛋白生产过程的效率;二是通过随机突变和大量筛选的方式逐步提高工程菌中重组蛋白的产量。然而,蛋白的生产涉及转录、翻译、跨膜、折叠、分泌和胞外稳定性等环节,任一环节都可能是瓶颈,已有的知识难以支撑我们通过理性设计的策略来解决问题。另一方面,现有的依赖于物理或化学等方式的随机突变方法效率较低。鉴于此,为了更好发挥随机突变策略的优势,本研究建立了四种随机突变方法,在转录、翻译和宿主等方面优化目标蛋白在B.subtilis中的表达水平,具体结果归纳如下。1 表达盒随机突变方法的建立表达盒包含启动子、核糖体结合位点、信号肽编码区、目标基因和转录终止子。表达盒的随机突变可以在转录和翻译等水平上提高蛋白表达量。针对现有方法存在库容小、质粒的不稳定或杂合子等问题。我们开发了直接将易错PCR产物插入B.subtilis染色体上的随机突变体文库构建方法。具体来说,首先建立了基于PCR的多片段组装方法,实现易错PCR产物、上下游同源区域和抗性标记的高效融合;然后,通过优化B.subtilis转化方法、增加同源臂长度和共表达同源重组促进蛋白NgAgo,提高线性DNA片段的转化效率。最终转化效率达5.3×105 CFU/μg DNA。整个突变体库构建过程可以在一天内完成。我们将上述方法进行应用,将甲基对硫磷水解酶（MPH）的表达量提高了 73%。2 表达盒在染色体上随机插入方法的建立表达盒在染色体上的插入位置会影响基因的表达水平,即位置效应。为了寻找表达盒合适的插入位置,我们建立了表达盒在染色体上随机插入的方法。具体来说,首先将含有表达盒和氯霉素抗性标记组装成一个转座子;然后将该转座子插入到博莱霉素抗性标记的启动子和核糖体结合位点之间,阻止博莱霉素抗性基因的转录;接着,诱导转座酶Himar1表达,促进转座子跳跃（跳跃后激活博莱霉素抗性）,跳跃事件可以通过氯霉素和博来霉素的双抗筛选。优化后的转座频率可以达到1.3×10-5。利用该方法为MPH表达盒筛选到几个更好的整合位点,包括ahpC,veg,crdA,qoxB和yjbH,与传统整合位点amyE相比,MPH的表达量分别提高了 12%,18%,25%,37%和50%。3 通过基因随机沉默来优化蛋白表达量的方法B.subtilis基因组中的某些基因对目标蛋白的表达是不利的,找到并失活这些基因可以提高目标蛋白产量。为此,我们开发了一种基于CRISPRi和引物池的方法来鉴定不利于目标蛋白表达的基因。为了构建了基因随机沉默文库,我首先设计了 3867条sgRNA,用于抑制B.subtilis中3867个非必需基因。然后,把表达盒和上述sgRNA随机融合,并将融合后产物转化到表达dCas9的菌株中,获得基因随机沉默文库。在含有50 mg/L毒死蜱的LB平板上筛选该文库,并对相应基因进行敲除验证,最终发现基因lysCB,yesV和yusG被失活后,MPH表达量分别提高了 58%,52%和11%。4 自发突变频率控制方法的建立工程菌的突变可通过物理诱变、化学诱变或自发突变实现,若自发突变的频率可以控制,则会具有安全和高效的优势。为此,我们用CRISPRi技术控制DNA聚合酶基因polC和纠错系统mutSL,同时诱导表达易错的DNA聚合酶,提高菌株的自发突变频率。具体来说,将Pxyl-dcas9表达盒和干扰mutSL基因的sgRNA编码序列构建在质粒pUS20中,通过木糖诱导dCas9的表达来抑制mutSL基因转录,宿主的自发突变率提高了 428倍。为进一步提高自发突变率,我们将含有木糖诱导表达的polC*和两条分别干扰mutSL和polC的sgRNA构建在质粒pUS20中,通过木糖诱导polC*和抑制mutSL和polC的基因转录来提高自发突变率。最高突变率相比于野生菌株提高了5128倍。此外,通过自发突变系统的使用,我们筛选到了 MPH和麦芽糖型淀粉酶AmyM的表达量提高的突变株,表达量分别提高了 42%和32%。5 甲基对硫磷水解酶MPH的高效分泌表达如何平衡菌体生长和蛋白表达对工程菌株生产重组蛋白的产量至关重要。为此,我们用CRISPRi控制目标基因的启动子来平衡蛋白的生产和菌体生长。具体来说,在发酵前期抑制启动子Pcry3A的转录,通过减小菌体的代谢压力来加速菌体生长,当菌体生物量增长到一个较高的水平后,解除对启动子Pcry3A的抑制使更多的细胞参与蛋白的生产。通过对sgRNA表达量和木糖添加量的优化后,菌株PDM35S生物量提高了 14%,MPH表达量提高了 38%。结果表明,CRISPRi技术可有效控制强启动子Pcry3A的转录,通过平衡重组蛋白的生产与细胞生长可有效提高重组蛋白的表达量。通过将上述结果进行综合,MPH的表达量达比出发菌株PDM提高了 3.85倍。综上所述,在B.subtilis中表达重组蛋白时可能遇到多种瓶颈。为了更好地利用随机突变策略突破这些瓶颈,本研究整合了 PCR和CRISPR等技术建立了四种随机突变方法,包括表达盒随机突变、表达盒在染色体上整合位置随机改变、基因随机沉默和自发突变频率控制。这些方法可能在转录、翻译、分泌、折叠和宿主等方面优化目标蛋白的产量。通过综合上述方法的应用,我们将MPH的表达量提高了 3.85倍,在摇瓶培养条件下最终蛋白产量达到2.1 g/L。如果能结合液滴微流控和流式细胞仪等高通量筛选方法,本研究建立的方法有望在蛋白表达和代谢工程等方面发挥重要作用。