论文部分内容阅读
目的: 本实验构建GSK-3β基因的过表达载体并转染树突状细胞系DC2.4,观察过表达GSK-3β对RelB蛋白水平的影响,以探究GSK-3β通过调节RelB的表达影响DC活化成熟的新机制,为确立GSK-3β作为自身免疫性疾病治疗的新靶点提供充分的科学依据。 方法: 1.小鼠BMDC的体外培养和鉴定以及GSK-3β的活性检测 采用我们实验室建立的方法,以低剂量的rmGM-CSF和rmIL-4在体外大规模诱导培养小鼠骨髓细胞分化成iDC和mDC。培养6天收集的细胞为iDC;收集前一天加入LPS刺激24h的细胞为mDC。两种细胞均通过CD11c+免疫磁珠分选纯化,并采用流式细胞术(FCM)检测CD11c的阳性率以鉴定细胞纯度、检测表面共刺激分子CD40和CD86的表达以鉴定细胞表型;利用qRT-PCR检测细胞因子表达情况;利用混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC刺激同种异基因T细胞增殖的能力。目的在于建立体外大规模培养iDC和mDC的体系,为后续研究DC活化成熟的机制奠定实验基础。利用LPS处理iDC30min和60min,western blotting检测GSK-3β的磷酸化水平,以观察GSK-3β在LPS诱导DC活化成熟过程中的活性变化。 2.GSK-3β对小鼠BMDC成熟和功能的作用和机制 利用GSK-3β的活性抑制剂SB216763处理原代BMDC24h,观察抑制GSK-3β的活性对BMDC成熟和功能的影响。FCM检测表面共刺激分子CD40和CD86的表达变化;qRT-PCR检测细胞因子IL-6、IL-12和IL-10 mRNA的表达;MLR检测其功能的变化。构建过表达GSK-3β的慢病毒载体并转染细胞系DC2.4,western blotting检测GSK-3β的过表达效率以及过表达GSK-3β对RelB蛋白水平表达的影响。 结果: 1.小鼠BMDC的体外培养和鉴定以及GSK-3β的活性检测 1.1 小鼠骨髓树突状细胞体外培养观察情况 培养至第六天,iDC集落逐渐增多增大,大多数仍疏松贴壁生长。iDC体积增大并开始伸出细小突起。经LPS刺激后,单个细胞从集落释放成为悬浮细胞,其个体增大,表面突起明显变长变粗,呈树枝状,具有典型mDC的形态特征。 1.2 小鼠BMDC的纯度和表型鉴定 CD11c是经典DC相对特异的表面标志,细胞表面CD11c的阳性率代表DC的纯度。我们利用免疫磁珠法纯化收集的细胞,再利用FCM检测细胞表面分子CD11c、CD40和CD86的表达,鉴定细胞的纯度和成熟度。经磁珠分选后,DC的纯度达到90%以上,符合分子生物学实验的要求。iDC组低表达共刺激分子CD40和CD86,而mDC组高表达CD40和CD86,完全符合imDC和mDC的表型特征。 1.3 小鼠BMDC细胞因子IL-6和IL-12 mRNA的表达情况 收集两组纯化后的细胞,qRT-PCR法检测IL-6和IL-12的表达。结果显示,iDC中IL-6(P<0.05)和IL-12(P<0.05)的mRNA水平显著低于mDC。 1.4 单向MLR评价小鼠BMDC刺激T细胞增殖的功能 将两组纯化后的DC分别按1∶10的比例与初始T淋巴细胞混合培养72小时,用CCK-8法检测T细胞的增殖情况。iDC组T细胞的相对增值率为(0.51±0.06),mDC组为(1.14±1.20),iDC组刺激T细胞活化的能力显著低于mDC组(P<0.01)。 1.5 GSK-3β在LPS诱导DC活化成熟过程中的活性变化 iDC GSK-3β216位酪氨酸(Tyr216)的磷酸化水平较高,而第9位丝氨酸(Ser9)的磷酸化水平较低,说明iDC中GSK-3β具有较高的活性。在LPS刺激后,Ser9的磷酸化水平显著高于未刺激组,相对应的Tyr216第则明显低于未刺激组,说明iDC经LPS刺激活化后GSK-3β活性下降。 2.GSK-3β对小鼠BMDC成熟和功能的作用及机制 2.1 抑制GSK-3β的活性对BMDC成熟和功能的影响 SB216763处理组与iDC组相比,表面共刺激分子CD40(P<0.01)和CD86(P<0.01)的表达显著上调,分别是未处理组的2.5和2.4倍;促炎因子IL-6(P<0.05)和IL-12(P<0.05)mRNA水平显著下调,差异有统计学意义,而抑炎因子IL-10 mRNA的表达显著上调(P<0.01);SB216763处理组DC刺激同种异基因T细胞增殖的能力较弱,与iDC相比没有显著差异。说明抑制GSK-3β促进DC表型成熟,但是其对促炎细胞因子的表达起抑制作用,且其刺激MLR的能力相当有限,提示抑制GSK-3β的活性不能激活DC完全成熟,经SB216763处理的DC在功能上仍然属于一种耐受型DC。另外,SB216763能够抑制LPS诱导IL-6(P<0.05)和IL-12(P<0.01)的表达上调,促进LPS诱导的IL-10的表达上调(P<0.01),阻断经LPS诱导成熟的DC刺激同种异基因T细胞增殖的功能,提示GSK-3β在LPS刺激DC活化过程中发挥促炎作用。 2.2 抑制GSK-3β对RelB表达的影响 利用携带小鼠GSK-3β基因的慢病毒载体转染DC2.4细胞,western blotting结果显示,GSK-3β过表达组中GSK-3β的表达明显高于空白对照组和空载转染组,相对应的RelB的表达低于空白对照组和空载转染组,说明过表达GSK-3β能下调RelB蛋白的水平。 结论: 1.利用低浓度的rmGM-CSF和rmIL-4刺激诱导小鼠BMDC分化形成大量的iDC,经磁珠分选后其纯度可达90%以上,iDC经LPS诱导形成mDC。经形态学、表型和功能分析,该方法培养的iDC和mDC完全符合DC的特征。 2.iDC中GSK-3β具有较高的活性,在LPS刺激后其活性显著降低,提示LPS可能通过诱导GSK-3β的失活调节DC的活化和成熟过程。 3.GSK-3β参与DC活化成熟的调控机制,一方面,高活性的GSK-3β抑制iDC的自发性成熟,抑制GSK-3β的活性能促进DC的表型成熟,但是经SB216763处理的DC在功能上仍然属于一种耐受型DC;另一方面,GSK-3β在LPS诱导DC成熟的过程中发挥促炎的作用。 4.过表达GSK-3β能降低DC成熟关键因子RelB的蛋白水平,提示在DC的未成熟阶段,GSK-3β可以通过降低RelB蛋白的水平维持DC的未成熟状态,为以GSK-3β为靶点诱导耐受型DC的形成以治疗SLE疾病奠定了实验基础并提供了理论支持。