【摘 要】
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目的:探究二甲双胍联合放射治疗在体内外对胶质母细胞瘤微环境内肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAMs）极化的影响以及在小鼠原位胶质母细胞瘤模型中的治疗作用。方法:1.通过MTS实验检测二甲双胍（Metformin,Met）对小鼠胶质母细胞瘤细胞系GL261-luc和CT-2A增殖能力的影响。2.将经Met及放射治疗处理后的GL261-luc细胞与诱导分化
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目的:探究二甲双胍联合放射治疗在体内外对胶质母细胞瘤微环境内肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAMs）极化的影响以及在小鼠原位胶质母细胞瘤模型中的治疗作用。方法:1.通过MTS实验检测二甲双胍（Metformin,Met）对小鼠胶质母细胞瘤细胞系GL261-luc和CT-2A增殖能力的影响。2.将经Met及放射治疗处理后的GL261-luc细胞与诱导分化后的小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDM）即TAMs共培养,通过流式细胞术检测各组处理后的GL261-luc对TAMs极化的影响情况。3.将小鼠胶质瘤细胞株GL261-luc立体定向移植到SPF条件下饲养的6周雌性C57BL/6小鼠的大脑额叶内,建立小鼠原位胶质瘤模型。待检测到肿瘤种植成功后（荧光值>10~6）,将56只荧光值相近的小鼠模型随机分为4组（n=14）:阴性对照组（NC组）;二甲双胍单药组（Met组,500mg/kg/d）;单纯放射治疗组（RT组,1次共8Gy）;二甲双胍联合放射治疗组（RT+Met组,RT,1次共8Gy+Met,500mg/kg/d）。通过流式细胞术,实时荧光定量PCR及免疫组化评价各组小鼠颅内肿瘤相关巨噬细胞的极化情况,并统计分析。4.每周利用小动物活体成像技术检测4组小鼠（n=8）脑内肿瘤生长情况,绘制肿瘤生长曲线并记录小鼠生存期。结果:1.Met抑制GL261-luc和CT-2A细胞增殖,且随浓度和作用时间增加效果越强。Met作用1天的IC50分别为28.38mmol/L和94.82mmol/L,3天的IC50分别为15.71mmol/L及14.71mmol/L。2.各组处理后的GL261-luc与BMDM共培养,对M2型巨噬细胞（M2-type macrophage,M2）在TAMs中占比的影响不同,Met处理后较NC组M2比例降低,17.33%vs 28.13%（p<0.005）。放疗后M2比例51.43%较NC组28.13%明显上升（p<0.001）,而RT+Met治疗后抑制放疗诱导的TAMs向M2型极化,M2比例较单纯放疗组与NC组都有下降,23.02%vs 51.43%vs 28.13%（p<0.005）。3.放射治疗促进TAMs募集并使其向M2型极化,体内肿瘤组织流式结果显示TAMs从NC组的4.38%升至RT组的9.36%（p<0.05）,而CD206+标记的M2占比从35.5%提高至80%（p<0.001）,IHC结果为RT后的CD68+的TAMs比例为22.44%高于NC组9.1%（p<0.05）,且CD206+的M2比例为16.02%高于NC组6.26%（p<0.05）。联合治疗可诱导肿瘤微环境中放疗募集的M2型TAMs向M1型极化,根据RT-PCR结果显示联合治疗后M2（IL-10+/Arg-1+）表达较NC组减少（p<0.05）而M1（NOS-2+/IRF-5+）表达增加（p<0.05）,且IHC结果示联合治疗后CD206+的M2型巨噬细胞比例为1.4%较RT组16.02%明显下降（p<0.001）,而联合治疗后i NOS+的M1比例14.15%较RT组1.56%显著上调（p<0.001）。4.与NC组相比,RT能够明显抑制小鼠体内胶质母细胞瘤的生长并延长小鼠生存期,RT组小鼠中位生存期为53天vs对照组37天（p<0.01）。二甲双胍联合放疗进一步协同抑制肿瘤的生长,治疗后每周测得的小鼠体内肿瘤荧光值均小于单纯放疗组和Met组（p<0.05）。小鼠的中位生存期由单纯放疗的53天延长至62天（p=0.128）。结论:1.二甲双胍能直接抑制胶质母细胞瘤的增殖,同时二甲双胍能抑制胶质母细胞瘤中的肿瘤相关巨噬细胞向M2极化,促进其向M1极化,重塑抗肿瘤免疫微环境。2.放疗能抑制小鼠胶质瘤的生长并改善其生存期,但同时促进了肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤局部的募集,并促使其向M2极化,产生了肿瘤免疫抑制的微环境。3.二甲双胍联合放疗可诱导肿瘤微环境中放疗募集的M2型TAMs向M1型极化,增强抗肿瘤疗效。
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