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柑桔溃疡病(CBCD)是严重危害世界柑桔种植业的一种细菌性病害,其病原物为地毯草黄单胞杆菌柑桔致病变种Xanthomonas axonopodis pv.citri(Xac)。CBCD广泛发生在世界各主要柑桔产区,包括亚洲、中东、非洲、太平洋和印度洋诸岛、澳大利亚、南美以及美国东南部的三十多个国家和地区均有不同程度的发生。我国的CBCD主要分布在福建、广东、广西、江西、浙江、湖南、湖北以及云、贵、川等南方柑桔种植区。该病能侵染绝大多数商品化栽培品种,虽然很少会直接杀死寄主,但会导致落叶、落果、树势衰弱和果实生锈斑且品质变劣,严重降低了果品的经济价值。
长期以来由于缺乏抗病品种和特效的化学防治药剂,对该病的防治主要采取加强非疫区建设与植物检疫来严防病害的传播,对病树采取挖除并集中烧毁的根除措施。柑桔非疫区建设的疫情监测和柑桔苗木、果品出入境检疫检验要求快速准确的诊断鉴定技术为支撑。
植物疫害生物的检测方法很多,包括症状目测法、病原菌分离培养及致病性测定法、噬菌体检测法、酶联免疫吸附法(ELISA)、斑点免疫结合法(DIA)、DNA杂交诊断法、DNA指纹图谱分析、PCR检测技术等,特别是常规PCR技术和荧光定量PCR检测技术的应用使植物疫害生物的检验检疫工作有了一种更加快速、准确、灵敏、便捷的检测方法。黄冠军建立了柑橘溃疡病菌的滚环扩增(RollingCircleAmplification,RCA)检测体系,RCA是一种恒温检测技术,不需要昂贵的PCR反应仪,并且能够对多靶标进行检测,同时避免了双重PCR及多重PCR进行多靶标检测时不同引物对之间的竞争和相互抑制常常影响到检测的特异性和稳定性导致检测体系不易优化的缺点。但RCA的步骤包括探针的环化、线性模板的消化以及滚环扩增,探针的环化通常采用热循环连接法,因此它并不是一种严格意义上的等温扩增,而且操作步骤较多,不适合向基层检验检疫部门推广。LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)是Notomi在2000年发明的一种新的恒温扩增技术,它灵敏度高,能达到比常规PCR低一个数量级的检测水平,同时针对靶序列六个特异性区域进行引物设计,因此具有比常规PCR更高的特异性。相比于常规PCR与荧光定量PCR,LAMP和RCA都属于恒温扩增技术,即整个扩增反应在恒温下进行。但不同于RCA,LAMP的操作步骤更为简单,所有步骤均可在水浴锅或其它恒温设备中进行,且反应时间仅需一小时。LAMP技术的特点及优势使其能很好的应用于基层检验检疫部门,提高基层检验检疫的效率及可靠性。
本研究根据设计的LAMP检测特异性引物建立并优化了柑桔溃疡病菌LAMP检测体系,该体系能够特异性地检出Xac的菌体细胞及其DNA,而检测不出供试的其它植物病原细菌和柑桔叶片表面常见的多种附生细菌,特异性检测结果与常规PCR相同;对Xac基因组DNA的检测灵敏度为2pg,对Xac菌悬液的检测灵敏度为20 cfu/μL,比常规PCR的检测灵敏度稍高。本试验成功地建立了柑橘溃疡病菌的实验室LAMP检测体系,通过对实际样品的检测,可以更好地验证LAMP检测体系的稳定性及实用性,从而使其能真正地应用于基层检验检疫部门。