多子小瓜虫(Ichthyophthiorus multifiliis)和刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)是目前经济鱼类养殖业最为普遍和危害性最大的两种寄生性纤毛虫。近年来，这两种纤毛虫给淡水和海水养殖业造成了巨大的经济损失。这两种寄生虫主要感染鱼皮肤和鳃，分别引起淡水和海水鱼类的“白点病”。本论文将从分子生物学角度，利用核糖体DNA(rDNA)基因序列对这两种寄生虫相关生物学特性进行分析，同时利用其种间的遗传差异性，对虫体及其内共生体进行鉴定，这将对这类纤毛虫的系统发育、诊断和基础生物学研究具有重要意义。 本论文分为四个部分： 1.刺激隐核虫rDNA ITS遗传标记的研究 2.利用rDNA ITS序列建立特异PCR检测方法 3.利用16S rDNA基因序列分析纤毛虫的内共生体 4.内共生体的定位及功能研究 本研究从分子遗传学角度出发，通过对不同地区多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis，Ich)和刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)的ITS-1及ITS—2进行PCR扩增和序列分析，确定其种间和种内差异性，以明确ITS-1及ITS—2是否可作为小瓜虫分子生物学分类的遗传标记。结果发现：来自不同地区的C.irritans的ITS-1和ITS—2序列差异性分别为0～1.6％和0～2.1％，而C.irritans与I.multifiliis之间的ITS-1和ITS—2之间的差异性分别为50.1～51.3％和52.6～53.3％，各地理株C.irritans和I.multifiliis的5.8S均不存在序列差异性，由此，我们成功的确立了ITS作为鱼类小瓜虫遗传标记的地位，并且ITS—2相对于ITS-1更为敏感，为C.irritans的分子生物学的进一步研究奠定了基础。 根据已经测得的C.irritans和I.multifiliis核糖体序列，通过网上Blast比对分析，设计、合成了针对C.irritans和I.multifiliis的特异性引物P1-S15和S01-S02，通过PCR条件优化和扩增后，他们均能特异的扩增出目的DNA片段，分别是540bp和280bp，其他对照样品均未见扩增出特异片段。敏感性试验可以检测到最低浓度为45pg/ul。通过冻融方法和巢式PCR敏感性可以检测到单个的幼虫，该方法特异性强、敏感性较高、重复性好，不仅可用于C.irritans和I.multifiliis的分类鉴定，也可用于它们所导致的寄生虫病的诊断和流行病学调查。 在同一物种中，核糖体16S相对保守，可以作为种间鉴定的标记序列。本研究通过16S rDNA序列的扩增、克隆、分析首次获得了多子小瓜虫I.multifiliis的内共生体序列。通过生物学软件应用分析获得的16S序列，成功的发现这些序列与I.multifiliis的18S序列截然不同，而与Flavobacterium家族，Ricketsiales家族和Bacteroidetes家族这三个细菌的基因家族存在着非常高的相似性。由此，我们成功的通过16S rDNA基因序列首次获得了I.multifiliis的三种内共生体。 在上面研究的基础上，根据已经获得的内共生体16S rDNA序列，通过网上比对，寻找其特异的基因区间，设计特异的DNA探针，通过荧光原位杂交技术(FISH)成功地确定其在I.multifiliis体内的位置，与大多数的纤毛共生体相似，位于I.multifiliis的胞质中，电镜观察结果同样证实内共生体分布在I.multifiliis报纸中，而非胞器内。