肿瘤是当今世界人类健康的主要威胁之一。目前的临床治疗中,放疗、化疗、手术切除等传统的治疗手段对晚期肿瘤和转移瘤的治疗效果有限。随着对机体抗肿瘤免疫机制探究的不断深入,免疫疗法逐渐成为极具潜力的肿瘤治疗手段。免疫治疗是通过激活或强化机体先天性和适应性免疫应答,达到特异性清除肿瘤细胞的治疗策略,对肾细胞癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、鼻咽癌等多种肿瘤治疗效果显著,是目前最有可能根除肿瘤的治疗策略。细胞免疫是机体抗肿瘤免疫的主要方式,在监视和防守肿瘤发生的过程中发挥了重要作用。但是,实体瘤中存在多种免疫逃逸和免疫抑制机制,如免疫检查点以及多种代谢途径（氨基酸代谢、脂肪酸代谢）等共同构成了肿瘤免疫抑制微环境,造成免疫疗法临床响应率低。肿瘤微环境（TME）中细胞代谢异常是引发免疫抑制的重要因素,靶向TME中代谢途径从而重塑肿瘤免疫代谢微环境为提高免疫疗法临床响应率提供了新的研究思路。其中,三磷酸腺苷（ATP）作为细胞内含量最丰富的代谢物之一,是细胞外环境中一种重要的生物信使分子。值得注意的是,ATP代谢通路在肿瘤免疫应答过程中同时发挥着抗肿瘤和促肿瘤的双向作用,因此,重塑ATP代谢通路、消除其负向作用对肿瘤代谢微环境具有重要意义。在TME中,细胞损伤过程中伴随着ATP的大量释放,ATP通过与树突状细胞（DCs）表面的嘌呤能受体结合将DCs招募到损伤部位以促进抗原的摄取和呈递,增强抗肿瘤免疫应答,在特异性免疫反应中起着至关重要的作用。然而,TME中存在一种负反馈机制——腺苷能轴,即通过胞外核苷酸酶CD73和CD39将ATP转化为具有免疫抑制效果的腺苷,腺苷通过与T细胞表面的A2A腺苷受体（A2AR）结合,抑制效应T细胞（Teff）的增殖和细胞毒性,并促进其向调节性T细胞（Treg）的分化。因此,ATP动员的免疫原性TME被逆转为免疫抑制的TME,不利于抗肿瘤免疫应答。综上,由于腺苷能轴的存在,ATP对抗肿瘤免疫的促进作用大打折扣,调节腺苷能轴十分关键。以往对抗腺苷能轴作用的策略主要集中在两个方面:一是通过抑制CD73活性减少ATP向腺苷的转化;二是阻断腺苷与T细胞表面A2AR的相互作用。这两种策略都是基于阻断腺苷能轴的思路,但是并不能消除腺苷在TME中的累积。因此,探索有效清除腺苷的策略具有重要意义且富有挑战。肌苷是TME中Teff的替代能源,可以在葡萄糖限制下恢复Teff的增殖和功能,是重要的免疫增强剂。值得注意的是,腺苷脱氨酶（ADA）能够催化腺苷转化为肌苷。因此,ADA可以通过将腺苷能轴的最终产物从免疫抑制剂转变为免疫增强剂来重新编程ATP代谢途径。与直接阻断腺苷能轴不同,这种“堵不如疏”的策略不仅可以实现腺苷抑制信号的消除,同时可以原位产生免疫调节剂来促进免疫反应。胞外ATP主要由损伤的肿瘤细胞释放。对于化疗来说,自噬依赖性的ATP释放是其导致免疫原性的关键,化疗和自噬诱导剂的协同作用可以级联增加ATP的释放,同时释放肿瘤相关抗原启动抗肿瘤免疫应答。因此,ADA、化疗和自噬诱导剂的结合不仅可以保证足够的ATP来激活免疫应答,而且可以重塑腺苷能轴,将其负反馈调节效应逆转为对抗肿瘤免疫的促进作用。受上述启发,本课题开发了一种可注射水凝胶策略。得益于海藻酸钠（SA）与肿瘤微环境钙离子（Ca2+）的络合作用,SA、ADA、自噬诱导剂苯-1,2,3-三羧酸（BTC）和化疗药物阿霉素（DOX）的水溶液可在肿瘤部位凝胶化形成可注射水凝胶（S@ABD）。在DOX和BTC的协同作用下,伴随着大量ATP释放的肿瘤细胞杀伤效应有效提高肿瘤免疫原性,启动抗肿瘤免疫应答。同时,ADA催化ATP的免疫负反馈产物腺苷转化为T细胞能源物质肌苷,逆转腺苷能轴的免疫抑制机制,三者的联合彻底重塑了腺苷能轴代谢平衡,实现了基于ATP的抗肿瘤免疫应答的级联放大,有效增强抗肿瘤免疫应答。具体研究内容如下:通过简单的物理混合法构建了可注射水凝胶体系,可以响应体内Ca2+,迅速完成溶胶-凝胶转变,扫描电镜（SEM）结果显示其拥有多孔层状网络结构,拥有原位储存和释放药物的潜力。同时S@ABD拥有良好的注射性能,可以用于原位注射给药并在体内转变为水凝胶作为原位治疗平台。为保证SA水凝胶及S@ABD水凝胶的安全性,首先对其体内外生物相容性进行了全面研究。结果表明SA水凝胶对上皮细胞毒性极小;注射后不引起机体异物反应;血液常规检测显示SA水凝胶在体内不引起系统性炎症和血液系统毒性;载药后的S@ABD水凝胶在体外无明显溶血现象,具有良好的生物相容性。选用B16F10黑色素瘤细胞作为体外细胞模型验证了 S@ABD的生物学效应。实验结果证明S@ABD有显著的细胞毒性,并且可以在杀死肿瘤细胞的同时造成大量的ATP、钙网蛋白（CRT）、高迁移率族蛋白1（HMGB1）等损伤相关分子模式（DAMPs）释放,因此S@ABD处理的肿瘤细胞可以显著活化DCs。T细胞增殖实验证明ADA可以有效将腺苷转化为肌苷,解除对T细胞的抑制并促进T细胞增殖。选用C57BL/6小鼠皮下注射B16F10细胞构建体内肿瘤评价模型。瘤内药物滞留试验证明瘤内注射S@ABD后可以原位形成药物储库,持续缓慢释放药物。建立双边肿瘤、肺转移和免疫记忆三个体内模型验证S@ABD水凝胶的抑瘤效果及免疫学效应。双边肿瘤模型中,S@ABD水凝胶显示出对原位肿瘤和远位肿瘤的显著抑制作用。流式检测结果证明,S@ABD治疗可以显著增加小鼠淋巴结中DCs的成熟度和肿瘤、脾脏中细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的比例,细胞因子检测结果证明治疗后肿瘤组织和血清中主要的炎性细胞因子含量有明显增加。因此S@ABD可以显著增强抗肿瘤免疫应答。同时,S@ABD水凝胶可以有效抑制肿瘤的肺转移,并且在小鼠体内形成了长期免疫记忆,对防止肿瘤复发有显著作用。综上所述,本课题设计了一种负载腺苷脱氨酶ADA、化疗药DOX和自噬诱导剂BTC的可注射水凝胶,瘤内注射后原位形成药物储库,通过三种药物的协同作用有效重塑腺苷能轴,持续激活体内抗肿瘤免疫应答,抑制肿瘤的生长和转移,并形成长期免疫记忆,为基于肿瘤腺苷代谢微环境的调控用于肿瘤免疫治疗提供了一种新的思路。