背景和目的： 成熟哺乳类动物中枢神经系统受到诸如缺血等原因的损伤后由于缺血中心大量神经元的死亡，造成严重的功能障碍。周围神经系统具有再生的能力，但是中枢神经系统再生能力有限。因此中枢神经系统的再生能力一直是神经科学中十分重视的问题。人们不断尝试各种可能的方法促进损伤后的中枢神经系统的再生，包括增加外源性营养因子、干扰体内的抑制因子、细胞移植等方法，并取得了一定的效果。近年来研究发现，嗅神经终身可以再生，并且再生的轴突可以穿越CNS-PNS交接区，重建突触联系。研究发现嗅神经的再生能力和嗅觉系统中的一种胶质细胞-嗅成鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)相关。人们通过OECs移植的体内、体外实验证实，OECs能介导受损的神经元的轴突再生出芽，并形成相应的突触联系，从而修复受损的中枢神经系统的功能，因此OECs成为研究中枢神经系统再生的热点。但是，OECs对缺血缺氧的中枢神经元凋亡的保护作用鲜有报导，尤其是OECs分泌的神经营养因子对中枢神经元的抗凋亡的作用如何?本研究建立了培养、纯化OECs的方法，制备OECs条件培养基，通过体外实验观察OECs条件培养基对缺血缺氧的皮层神经元的抗凋亡作用，进一步探讨OECs细胞对中枢神经系统的保护作用。 材料与方法： 1、细胞培养： 1.1.嗅成鞘细胞的原代培养从出生1～2天的SD(Sprague-Dawley,SD)大鼠的嗅球(Olfactory Bulb，O B)取材进行OECs原代培养。利用差速贴壁方法进行纯化培养，清除绝大部分神经元及其它混杂细胞，使细胞成分相对单一化。低亲和力神经生长因子受体抗体(loW affinity．growth factor receptor,p75NGR)免疫染色鉴定OECs，待其融合度达70％左右时，制备条件培养基。 1.2.皮层神经元的原代培养从出生24小时内的SD(Sprague-Dawley，SD)大鼠的大脑半球取材进行皮层神经元的原代培养。通过降低血清浓度和加入阿糖胞苷(Ara-C)进行纯化培养，清除绝大部分胶质细胞及其它混杂细胞，使细胞成分相对单一化。MAP-2免疫染色鉴定皮层神经元，培养至第5～6天，制备缺血缺氧模型。 1.3.条件培养基的制备OECs纯化培养后，待其融合度达70％左右时，去除原有培养基，加入无血清的培养基，培养24小时后取出作为条件培养基备用。 2、缺血缺氧皮层神经元模型的制备皮层神经元培养至第6天，分为三组： (1)正常对照组，按正常的半量换液。 (2)缺血缺氧组，撤除正常神经元培养基，换为缺氧液，放入密闭容器中，通入5％CO2和95％N2，密闭培养两个小时后，换为复氧液，继续培养6小时。 (3)OECs条件培养基组，皮层神经元培养至第5天，撤除正常神经元培养基，加入OECs条件培养基，继续培养24小时后，制备缺血缺氧模型。 使用Hochest33342、MTT、Tunel试剂盒检测神经元的凋亡和存活率。 主要结果与结论： 主要结果： (1)采用差速贴壁法进行OECs纯化培养，细胞增长快，纯度可达90％； (2)采用降低血清浓度和添加阿糖胞苷法进行皮层神经元纯化培养，细胞活性良好，纯度可达95％； (3)通过缺血缺氧模型，Hochest33342染色可见皮层神经元胞核固缩、碎裂，MTT法检测细胞存活率可见通过缺血缺氧后神经元存活率下降为(48.82±1.76)％，通过OECs条件培养基预处理后，神经元存活率上升为(78.13±3.09)％。Tunel显示神经元的凋亡率明显升高为(51.5±5.68％)，经过OECs条件培养基预处理之后，神经元的凋亡率较缺血缺氧组明显减低为(25.83±8.64％)。 (4)统计学分析表明，OECs条件培养基可以保护中枢神经元，降低死亡率，具有抗凋亡的作用。 结论： (1)差异贴壁法纯化嗅成鞘细胞简单易行、费用低廉，增殖迅速，可获得纯度高达90％以上的OECs； (2) 降低血清浓度和添加阿糖胞苷法进行皮层神经元纯化培养，细胞活性良好，轴突交织成网状，可获得纯度高达95％的皮层神经元； (3)利用体外皮层神经元的缺血缺氧模型，可以诱导细胞凋亡，较好的模拟体内脑梗死后的凋亡状态，利于研究脑梗死的保护因素和功能修复； (4)OECs条件培养基可以保护皮层神经元，减少细胞凋亡，提高细胞存活率。