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目的:感光细胞凋亡是视网膜退行性疾病(Retinal Degenerative,RD)的关键致病因素,小胶质细胞活化可加重感光细胞凋亡,JAK2/STAT3通路与胶质细胞分化和神经元凋亡密切相关,前期证明针刺可能通过抑制视网膜小胶质细胞活化影响感光细胞凋亡,但具体机制尚需进一步探究。本研究拟探索针刺调控JAK2/STAT3通路抑制视网膜小胶质细胞活化进而减缓感光细胞凋亡的确切效应和作用机制。方法:1.小胶质细胞在感光细胞凋亡模型中的活化研究(1)感光细胞凋亡大鼠模型中视网膜小胶质细胞的迁移、活化:SD大鼠分为空白组、模型1天组、模型7天组、模型14天组、模型28天组,模型组大鼠均采用MNU腹腔注射方法建立模型,通过HE染色和TUNEL法分别观察视网膜形态及感光细胞凋亡情况,免疫荧光法观察视网膜小胶质细胞迁移状态。(2)体外葡萄糖剥夺感光细胞凋亡模型建立与评估:采用葡萄糖剥夺法对体外661W细胞进行4h、8h、12h、24h不同时间点的能量衰竭葡萄糖剥夺培养,建立661W细胞凋亡模型,通过LDH和流式细胞术检测细胞坏死和凋亡表达。(3)体外感光细胞凋亡模型中小胶质细胞的活化:建立4h、8h、12h、24h四个时间点体外661W细胞凋亡模型与BV2小胶质细胞共培养体系,采用流式细胞术检测各时间点661W细胞凋亡表达,ELISA法检测小胶质细胞IL-1β、TNF-α炎性因子水平。2.抑制感光细胞凋亡模型JAK2/STAT3通路对小胶质细胞活化的机制研究(1)抑制JAK2/STAT3通路对视网膜小胶质细胞活化、迁移的影响:建立感光细胞凋亡SD大鼠模型,分为空白组、模型组、二甲基亚砜(DMSO)阴性对照组、JAK2/STAT3通路拮抗剂AG490低中高剂量组(5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg),通过HE和TUNEL法观察视网膜形态变化和感光细胞凋亡情况,免疫荧光法标记观察视网膜小胶质细胞迁移活化状态,Western blot和RT-PCR用于检测视网膜中JAK2、STAT3蛋白和m RNA表达。(2)抑制JAK2/STAT3通路对体外小胶质细胞活性的影响:建立体外661W细胞凋亡模型与BV2小胶质细胞共培养体系,应用JAK2/STAT3通路拮抗剂AG490低中高浓度(10umol、50umol、100umol)处理共培养体系,流式细胞术检测661W细胞凋亡表达,ELISA法检测小胶质细胞IL-1β、TNF-α炎性因子水平,Western blot检测JAK2、STAT3蛋白表达,RT-PCR法检测其m RNA水平。3.针刺调控感光细胞凋亡模型JAK2/STAT3通路抑制视网膜小胶质细胞活性效应及机制研究(1)针刺抑制视网膜小胶质细胞活化的效应研究:建立感光细胞凋亡大鼠模型,分为空白组、模型组、维生素A组、假针刺组及针刺组。各组分别干预28天后,HE染色和TUNEL法分别观察各组大鼠视网膜组织形态改变和感光细胞凋亡结果;免疫荧光法观察各组大鼠视网膜小胶质细胞标记物Iba1迁移情况,ELISA用于检测IL-1β、TNF-α表达水平。(2)针刺调控JAK2/STAT3通路抑制视网膜小胶质细胞活性的机制研究:建立感光细胞凋亡大鼠模型,分为空白组、模型组、维生素A组、假针刺组及针刺组。各组分别干预28天后,通过Western blot和RT-PCR分别检测大鼠视网膜组织中JAK2/STAT3信号通路关键因子JAK2、STAT3、IL-6、MCP1和SOCS3蛋白及m RNA表达。结果:1.小胶质细胞在感光细胞凋亡模型中的活化研究(1)成功建立MNU感光细胞凋亡大鼠模型,造模1天组视网膜可见排列略松散,模型7天组大鼠视网膜各层排列紊乱;模型14天组感光细胞固缩明显;模型28天组视网膜细胞排列紊乱,内外核层细胞数量明显减少;视网膜外核层厚度与造模时间成正相关;TUNEL检测可见除空白组外,其余各组视网膜凋亡率随时间延长而上升,模型28天组凋亡率最高;免疫荧光可见空白组大鼠视网膜Iba1表达主要位于视网膜内层并处于静息状态;模型1天组可见Iba1(+)的呈现少量迁移状态,模型7天组Iba1(+)呈迁移状态,且细胞突触可见细长状外观;模型14天组可见视网膜外层大量外观呈阿米巴样Iba1(+),模型28天组大鼠视网膜中Iba1(+)呈明显阿米巴样,并维持稳定状态。(2)成功建立体外葡萄糖剥夺条件下感光细胞凋亡模型,661W细胞的形态在4h葡萄糖剥夺后未见明显变化,8h组可见一部分细胞的细胞膜呈破坏状、胞体回缩;12h组细胞则呈突触变长,细胞形态从扁平形态变化为不规则形状,漂浮细胞增多;24h组661W细胞膜损坏,胞体回缩明显,可见细胞解体。葡萄糖剥夺8h组、12h组、24h组661W细胞坏死率和凋亡率明显高于正常组(均P<0.01),4h葡萄糖剥夺组细胞坏死率和凋亡率均略高4h正常组;661W细胞坏死率和凋亡率与葡萄糖剥夺时间成正相关,24h凋亡率达86.30±3.43%,说明体外感光细胞凋亡模型建立成功。(3)建立661W细胞凋亡模型与BV2小胶质细胞共培养系统,随着共培养时间延长,661W细胞凋亡率上升,在共培养24h后BV2小胶质细胞+葡萄糖剥夺661W细胞组凋亡率(81.24±3.32%)明显高于空白组(P<0.01),与葡萄糖剥夺661W细胞共培养的小胶质细胞IL-1β和TNF-α炎性因子水平随时间进展而升高,24h后IL-1β和TNF-α炎性因子水平达到最高点。2.抑制感光细胞凋亡模型JAK2/STAT3通路对小胶质细胞活化的机制研究(1)通过拮抗剂AG490腹腔注射MNU模型大鼠以阻断JAK2/STAT3通路,结果可见各AG490干预组大鼠视网膜感光细胞数量较模型组和阴性对照组降低,AG490高剂量组凋亡率显著低于模型组(P<0.01),模型组可见视网膜下腔及外核层,大量Iba1(+)表达,随着AG490剂量增加各组Iba1(+)表达呈减少趋势,AG490高剂量组视网膜外核层的Iba1(+)细胞明显少于模型组;Western blot和RT-PCR结果显示AG490低中高剂量组JAK2、STAT3蛋白水平均低于模型组(均P<0.01)。(2)各浓度AG490拮抗剂处理后,共培养体系中IL-1β和TNF-α炎性因子表达、661W细胞凋亡率均低于模型组,JAK2、STAT3蛋白和m RNA水平随拮抗剂剂量增高表达呈现降低趋势,高剂量组蛋白和m RNA水平显著低于其他组别(P<0.01)。3.针刺调控感光细胞凋亡模型JAK2/STAT3通路抑制视网膜小胶质细胞活性效应研究(1)各组大鼠HE染色观察到空白组大鼠视网膜结构未见明显改变,模型组视网膜排列松散不规则,假针刺组大鼠视网膜变化与模型组改变相似,但较模型组轻,维生素A组及针刺组对比模型组有所改善;TUNEL法检测感光细胞凋亡可见针刺组凋亡数量少于模型组(P<0.05),模型组小胶质细胞标记物Iba1(+)表达则主要位于外核层和视网膜下腔;与模型组比较,假针刺组Iba1表达减少,维生素A组及针刺组Iba1表达明显弱于模型组;模型组IL-1β、TNF-α表达明显高于空白组,针刺组IL-1β、TNF-α水平显著低于模型组(均P<0.01)。(2)Western blot和RT-PCR检测结果示针刺组视网膜JAK2、STAT3、IL-6和MCP1蛋白及m RNA表达均显著低于模型组,SOCS3蛋白、m RNA表达较模型组显著升高(均P<0.01)。结论:1.JAK2/STAT3通路在小胶质细胞活化中具有重要作用,拮抗JAK2/STAT3通路能够降低小胶质细胞炎性水平,抑制其活化迁移状态,减缓感光细胞凋亡进程;2.针刺一定程度上能够抑制视网膜小胶质细胞迁移活化,降低小胶质细胞IL-1β、TNF-α炎性因子释放,对RD感光细胞病理变性过程有减缓、保护作用,其机制与上调JAK2/STAT3通路关键因子JAK2、STAT3、IL-6和MCP1,下调SOCS3因子相关。