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随意型皮瓣指在皮瓣中不含轴型血管,仅有真皮层血管网、真皮下层血管网进行血供,当其长宽比例过大(长:宽>3:1)时称为超长随意皮瓣,皮瓣远端会出现血运循环障碍,导致皮瓣坏死。由于临床中需要修复的创面不规则,使得超长随意皮瓣的需求增多。但是,由于超长随意皮瓣静脉淤血并发症引起皮瓣坏死的问题导致超长随意皮瓣在临床上的使用受到限制。活体水蛭疗法是将水蛭放置在淤血皮瓣上,通过水蛭的吸吮作用和分泌抗凝血物质使得皮瓣瘀滞的血液排出,防止血液凝固保持血流通畅。活体水蛭疗法被认为是救治皮瓣静脉淤血并发症的标准疗法,但是由于活体水蛭生活习性使得其推广受到限制,同时活体水蛭携带多种病菌使得其临床应用受到限制。天然水蛭素是活体水蛭发挥抗凝作用的物质之一,是凝血酶的特异性拮抗剂。我们前期研究发现动物皮瓣术后可出现缺血缺氧、凝血酶增多启动炎症瀑布式反应等多种因素影响皮瓣存活,而大鼠背部超长随意皮瓣术后局部注射天然水蛭素能增加动物皮瓣成活面积,其机制与天然水蛭素抗炎症反应、抗氧化作用、促血管生成作用有关,但天然水蛭素对血管内皮细胞凋亡作用的相关分子机制研究尚少。酪氨酸蛋白激酶/信号转导子和转录激活子(Janus activated kinase signal transducer and activator of transcriptions,JAK/STAT)是近年来研究较多的细胞内信号转导通路家族,JAK/STAT通路与炎症反应、氧化应激、细胞损伤、凋亡等密切相关,当中JAK2/STAT1信号通路与细胞凋亡相关。在本研究中,我们将通过体内实验,研究天然水蛭素对术后皮瓣组织细胞凋亡作用影响,在此过程中进一步探究天然水蛭素发挥作用的过程中是否涉及对JAK2/STAT1通路的调控影响;另通过体外实验进一步研究天然水蛭素分别在凝血酶干预和缺血缺氧环境下对人微血管内皮细胞凋亡的影响,以及当中对JAK2/STAT1通路的调控影响。第一部分:天然水蛭素对大鼠超长随意型皮瓣淤血损伤的保护作用目的:在这部分研究中,我们将探讨天然水蛭素对大鼠背部超长随意皮瓣组织中的细胞凋亡的作用及可能涉及的信号通路。方法:实验选取健康的SD大鼠,共24只,雌雄不限,体重250-300g,随机分成两组天然水蛭素组(Hirudin组)和对照组(Control组),每组12只,在大鼠背部建立超长随意皮瓣。Hirudin组每天在大鼠超长随意皮瓣皮下局部注射天然水蛭素一次,每次注射4ATU天然水蛭素,Control组与Hirudin组相同时间点对大鼠背部皮瓣局部注射等量生理盐水。术后观察皮瓣成活情况;术后第一天和第五天截取背部皮瓣组织标本制成切片,进行原位末端转移酶标记法(TUNEL染色)检测组织细胞凋亡情况;另制备组织切片,采取免疫组织化学方法分析皮瓣中细胞磷酸化JAK2(P-JAK2)和磷酸化STAT1(P-STAT1)的表达情况;提取组织标本的总蛋白,通过免疫印迹法(Western blot)和吸光光度法检测皮瓣组织中P-JAK2和P-STAT1的含量。结果:1)TUNEL检测:术后第一天,Hirudin组TUNEL阳性细胞的数量较Control组阳性细胞的数量少(P<0.05),术后第五天,Hirudin组阳性细胞数量较Control组的少(P<0.05)。Hirudin组的TUNEL 阳性细胞数量术后第五天比术后第一天升高(P<0.05),Control组标本中TUNEL阳性细胞数量术后第五天比术后第一天升高(P<0.05)。术后各时间点Control组都较Hirudin组TUNEL 阳性细胞数量高(P<0.05)。2)免疫组织化学方法分析:术后第一天和第五天时,Control组皮瓣P-JAK2和P-STAT1阳性细胞数均高于Hirudin组(P<0.05)。3)P-JAK2表达量:Hirudin组术后第五天有显著上升(P<0.05 v.s day1)。Control组在术后第一天和第五天都有显著上升,且第五天的表达量较第一天高(P<0.05)。术后第一第五天Control组的P-JAK2表达量均高于Hirudin组(P<0.05)。4)P-STAT1表达量:Hirudin组术后第五天有显著上升(P<0.05 v.s day 1)。Control组在术后第一天和第五天都有显著上升,且第五天的表达量较第一天高(P<0.05)。术后第一第五天Control组的P-STAT1表达量均高于Hirudin组(P<0.05)。结论:(1)术后皮下注射天然水蛭素可改善皮瓣淤血提高皮瓣成活面积;(2)超长随意皮瓣术后会有细胞凋亡发生,其机制与JAK2/STAT1通路有关;(3)天然水蛭素局部皮下注射能降低超长随意皮瓣术后的细胞凋亡,机制与JAK2/STAT1通路有关。第二部分:正常培养环境下天然水蛭素对人微血管内皮细胞保护作用相关机制研究目的:研究在正常培养环境下天然水蛭素对抗凝血酶对人微血管内皮细胞的保护作用及相关机制通路。方法:取对数生长期的人微血管内皮细胞实验,将细胞分组为:①正常组(Nor组)②凝血酶组(T组),2U/ml凝血酶③天然水蛭素组(H组),2ATU/ml水蛭素④凝血酶组+天然水蛭素(T+H组),2ATU/ml水蛭素+2U/ml凝血酶⑤AG490组(AG组),50μmol/LAG490⑥凝血酶+AG490组(T+AG490 组),2U/ml 凝血酶+50μmol/LAG490⑦天然水蛭素+AG490 组(H+AG490组),2ATU/ml水蛭素+50μmol/LAG490⑧凝血酶+天然水蛭素+AG490 组(T+H+AG490 组),2ATU/ml 水蛭素+2U/ml 凝血酶+50μmol/LAG490。加药培养24小时后用流式细胞检测各组细胞凋亡情况;用Tunel法检测各组细胞凋亡的情况;用细胞荧光免疫法检测各组细胞P-JAK2的表达情况。结果:正常组、水蛭素组、AG490组、天然水蛭素+AG490组的细胞凋亡率较低,差异无统计学意义(P>0.05);凝血酶组人微血管内皮细胞凋亡率为23.15±0.92%,较正常组升高(P<0.05);天然水蛭素+凝血酶组细胞凋亡率较凝血酶组降低(P<0.05);凝血酶+AG490组细胞凋亡率较凝血酶组降低(P<0.05),较凝血酶+天然水蛭素组和凝血酶+天然水蛭素+AG490组凋亡率高(P<0.05);凝血酶+天然水蛭素组与凝血酶+天然水蛭素+AG490组凋亡率相比较差异无统计学意义(P>0.05);细胞荧光免疫双染结果显示,细胞出现凋亡的同时也表达P-JAK2,各组细胞P-JAK2阳性率趋势与细胞凋亡率趋势相同。结论:在正常的培养状态下,凝血酶可诱导人微血管内皮细胞凋亡,其机制与凝血酶激活JAK2磷酸化有关。天然水蛭素可降低凝血酶诱导的人微血管内皮细胞凋亡,其机制为通过拮抗凝血酶对P-JAK2的激活作用,阻断凝血酶诱导人微血管内皮细胞的凋亡。天然水蛭素拮抗凝血酶减少细胞凋亡的过程中不只JAK2/STATs一条通路。第三部分::缺血缺氧条件下天然水蛭素对人微血管内皮细胞保护作用相关机制研究目的:研究在缺血缺氧环境下天然水蛭素对人微血管内皮细胞凋亡的影响。方法:取对数生长期的人微血管内皮细胞实验,将细胞分组为:①缺氧对照组(NO组)②凝血酶组(T组),2U/ml凝血酶③天然水蛭素组(H组),2ATU/ml水蛭素④天然水蛭素+凝血酶组(T+H组),2ATU/ml水蛭素+2U/ml凝血酶⑤AG490组(AG组),50μmol/LAG490⑥凝血酶+AG490组(T+AG490 组),2U/ml 凝血酶+50μmol/LAG490⑦天然水蛭素+AG490 组(H+AG490组),2ATU/ml水蛭素+50μmol/LAG490⑧天然水蛭素+凝血酶+AG490 组(T+H+AG490 组),2ATU/ml 水蛭素+2U/ml 凝血酶+50μmol/LAG490。各组细胞经受缺氧刺激24小时后用流式细胞检测各组细胞凋亡情况;用Tunel法检测各组细胞凋亡的情况;用细胞荧光免疫法检测各组细胞P-JAK2的表达情况;将各组细胞总蛋白提出用Western Blot方法检测JAK2和STAT1的磷酸化水平。结果:缺氧对照组人微血管内皮细胞凋亡率为43.93±0.44%,当培养基中加入2U/ml凝血酶时,细胞凋亡率较缺氧对照组显著升高(P<0.05);当培养基中加入2U/ml天然水蛭素时,细胞在缺氧条件下的凋亡率与缺氧对照组比较差别无统计学意义,而当培养基中加入2U/ml凝血酶时应用天然水蛭素对抗凝血酶后,可降低细胞凋亡(P<0.05);当培养基中加入50μmol/LAG490时,细胞凋亡有减少,但与缺氧对照组比较差别无统计学意义;而当培养基中加入2U/ml凝血酶时应用AG490可降低细胞凋亡(P<0.05),但较T+H组凋亡率高(P<0.05)。缺氧可造成人微血管内皮细胞的JAK2和STAT1磷酸化水平升高,在缺血缺氧的培养环境下凝血酶的出现可使得人微血管内皮细胞内的JAK2和STAT1磷酸化水平进一步升高(P<0.05)。天然水蛭素可抑制凝血酶诱导的细胞内JAK2和STAT1磷酸化(P<0.05),却不能抑制缺氧诱导的细胞内JAK2和STAT1磷酸化(P>0.05)。结论:1)缺氧可引起人微血管内皮细胞凋亡;2)缺氧状态下凝血酶可进一步的刺激JAK2和STAT1磷酸化,增加人微血管内皮细胞凋亡;3)天然水蛭素对缺氧诱导的人微血管内皮细胞凋亡没有保护作用;4)天然水蛭素可减少缺氧条件下凝血酶诱导的人微血管内皮细胞凋亡;5)天然水蛭素和JAK2抑制剂AG490可以通过拮抗凝血酶对JAK2通路激活作用,阻断凝血酶诱导人微血管内皮细胞的凋亡。