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原发性开角型青光眼（Primary Open-Angle Glaucoma，POAG）是由于眼内压升高而引起的一种不可逆的致盲眼病，其致病机制与小梁细胞形态、骨架结构及生理功能密切相关。近期相关文献报道小梁细胞骨架结构发生异常改变，能引起眼压升高，有可能诱发原发性开角型青光眼。氯离子通道家族具有调控生物体内细胞的兴奋度、跨上皮细胞内的物质转运、pH值及生物体内细胞容积等多种功能，另外还对细胞分化、细胞增生、细胞凋亡及免疫应答等生理功能有着一定的调控作用。电压门控性氯离子通道(Voltage-Gated Chloride Channel，简称ClC)是氯离子通道家族的一员，目前共发现9种ClC型氯离子通道，ClC-2是ClC型氯离子通道中的一种。本项目组已证实ClC-2存在于小梁细胞，并且能调控小梁细胞多项生理活动。本实验应用RNA干扰技术，观察ClC-2表达与小梁细胞骨架结构的关系，并探讨ClC-2对小梁细胞骨架结构影响的作用机制。方法：1）ClC-2-siRNA设计、合成及活性筛选：根据ClC-2基因mRNA序列，利用计算机相关软件设计合成ClC-2-siRNA，利用Realtime-PCR，Western Blot技术检测ClC-2-siRNA对ClC-2表达的影响。2）ClC-2对人小梁细胞骨架的影响：利用Real time-PCR，WesternBlot及免疫荧光技术检测ClC-2-siRNA对Actin，Vinculin，β-catenin表达的影响。3）ClC-2对人小梁细胞骨架结构影响的机制研究：构建人小梁细胞体外青光眼模型；利用Real time-PCR，Western Blot检测体外青光眼模型小梁细胞ClC-2的表达；利用Western Blot检测TGF-β/Smad信号转导通路的表达。结果：1）本实验引进美国ScienCell公司的正常人小梁细胞作为实验细胞株，并且应用了相应的成纤维细胞培养基，细胞单层螺旋状排列，为梭形，生长良好，成功进行了传代及冻存，为后续实验奠定了良好基础。由于目前没有特异的针对ClC-2的阻断剂,为了研究ClC-2的活性与小梁细胞骨架的关系，因此我们应用了RNAi干扰技术。根据ClC-2基因序列和RNAi的设计原则，应用siRNA设计软件，分别设计了ClC-2-siRNA1，ClC-2-siRNA2.同时本文针对ClC-2-siRNA1设计了反相siRNA(scRNA)作为对照。结果证实ClC-2-siRNA最佳的转染浓度是100pmol，最佳作用时间是转染后24h。ClC-2-siRNA1对ClC-2mRNA及蛋白表达的抑制效果优于ClC-2-siRNA2。2）小梁细胞骨架的正常结构是维持小梁细胞功能的重要基础。我们主要研究ClC-2活性与小梁细胞骨架结构是否存在某种关联，是否与原发性开角型青光眼的发病机制有关系？肌动蛋白和粘着斑蛋白是小梁细胞主要的骨架蛋白，β-链蛋白是一种黏附因子，能增加细胞之间的粘合程度。我们用免疫荧光染色技术、RT-PCR、Western Blot的方法对比了正常小梁细胞和转染后的小梁细胞骨架的变化，以及肌动蛋白、粘着斑蛋白和β-链蛋白表达变化。结果发现转染后的小梁细胞的细胞骨架受到了一定的影响，细胞骨架的肌动蛋白发生紊乱，肌动蛋白肌丝出现了扭曲交联，微丝虽然增加但失去了正常的排列。黏着斑蛋白排列发生了变化，无法沿着肌动蛋白微丝进行有序排列。同时转染后的小梁细胞的肌动蛋白、粘着斑蛋白和β-链蛋白的蛋白含量、mRNA表达较正常增加，差异有统计学意义。3）小梁细胞体外青光眼模型的细胞形态与正常小梁细胞区别不大，主要是细胞体积略大，核偏圆，排列略显不规则。我们应用RT-PCR、Western Blot的方法检测体外青光眼模型小梁细胞的ClC-2的表达较正常小梁细胞下降，差异具有统计学意义；其肌动蛋白、粘着斑蛋白和β-链蛋白的蛋白含量、mRNA表达较正常增加，差异具有统计学意义。转化生长因子（TGF-β）在POAG发病机制中起着重要的作用，为了探讨ClC-2活性对小梁细胞骨架影响的机制，我们应用RT-PCR、Western Blot方法检测了ClC-2-siRNA转染后的小梁细胞TGF-β和Smad2的表达。结果发现ClC-2-siRNA转染后的小梁细胞的TGF-β和Smad2的表达较正常小梁细胞增加，差异有统计学意义，推测TGF-β/Smad转导通路可能在ClC-2对小梁细胞骨架影响过程中发挥了重要作用。结论：1）ClC-2对人小梁细胞骨架结构具有保护作用。2）ClC-2对人小梁细胞骨架结构具有的保护作用可能与TGF-β/Smad信号转导通路有关