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目的:在生命进程中,细胞稳态时刻承受着来自机体内外有害因素、遗传因素和病理因素的威胁,从而引发DNA损伤,导致基因组完整性和稳定性“平衡失调”。生命个体在发展进程中获得了一系列包括DNA损伤修复反应(DNA damage response,DDR)、细胞周期检查点、细胞凋亡与坏死、细胞衰老与细胞自噬等细胞稳态维护机制,承担着维持细胞稳态的重要使命。DNA损伤修复反应体系的“动态平衡”是维系基因组完整性和稳定性的重要保障,其“平衡失调”将导致疾病的发生。近年研究发现,蛋白质的翻译后修饰能够调控DNA损伤修复反应从而影响基因组的完整性和稳定性。蛋白质的翻译后修饰有多种方式,主要包括甲基化、糖基化、乙酰化、磷酸化等。探索蛋白质的翻译后修饰对DNA损伤修复反应的调控是该领域目前研究的热点。SAMHD1基因最初在人树突状细胞的cDNA文库中被发现,其蛋白质结构包括SAM结构域和HD结构域。近几年关于SAMHD1研究的热点主要在其抗病毒感染功能上。SAMHD1是目前在真核细胞中发现的第一个脱氧核糖核苷三磷酸水解酶(dNTPase),可将细胞内的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)水解为核苷和三磷酸,在调节细胞dNTP含量的动态平衡方面起着至关重要的作用,而后者是DNA损伤修复所必需的原料分子。SAMHD1可在Thr592位点被磷酸化修饰,影响dNTPase活性从而影响dNTP含量参与DNA损伤修复反应。研究发现SAMHD1的突变与Aicardi-Goutières综合症(AGS)有着密切的关系,在患者成纤维细胞中检测到了dNTP水平增加和慢性DNA损伤。而在慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)患者中,发现SAMHD1会影响DNA损伤诱导后的细胞增殖和存活。有文章报道SAMHD1的乙酰化修饰可能参与肿瘤的发生,提示我们SAMHD1蛋白参与DDR,其乙酰化修饰可能对DDR发挥调控作用。这些发现提示了在疾病的发病机制中SAMHD1和DNA损伤反应之间的新联系。研究团队在前期系列性研究成果中证实:DNA损伤诱导SAMHD1磷酸化修饰增强。本研究旨在探索SAMHD1蛋白新的表观遗传学修饰—乙酰化修饰调控及其对DNA损伤修复反应的影响,进而为阐明DNA损伤修复分子机制和基因组稳态维系机制提供新视角,为临床DNA损伤相关疾病的治疗提供新策略。研究方法:1.本研究首先在人胚胎肾293(HEK293)细胞中,利用泛乙酰化抗体完成免疫共沉淀过程,通过蛋白质免疫印迹法证实SAMHD1蛋白可以发生乙酰化修饰,并且寻找到其乙酰基转移酶。2.细胞给予DNA损伤刺激(Doxorubicin,DOX),来模拟DNA损伤。利用泛乙酰化抗体完成免疫共沉淀过程,蛋白质免疫印迹法检测SAMHD1乙酰化修饰水平。3.组蛋白去乙酰化酶家族(histone deacetylase,HDAC)抑制剂Trichostatin A(TSA)和Nicotinamide(NAM)处理HEK293细胞,蛋白质免疫印迹法检测SAMHD1蛋白乙酰化修饰水平和磷酸化(T592)修饰水平。4.文献提示:SAMHD1的K405位点是SAMHD1蛋白乙酰化修饰位点。点突变质粒构建技术和Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9(CRISPR-Cas9)技术构建pcDNA4/flag-myc-hisSAMHD1(K405R)质粒和稳转HEK293(Cas9-Samhd1)细胞。pcDNA4/flag-myc-hisSAMHD1(WT)质粒和pcDNA4/flag-myc-his-SAMHD1(K405R)质粒转染稳转HEK293(Cas9-Samhd1)细胞,蛋白质免疫印迹法检测SAMHD1蛋白乙酰化修饰水平。给予DNA损伤刺激DOX(0.5μM),蛋白质免疫印迹法和免疫荧光法检测SAMHD1磷酸化修饰水平和DNA损伤修复反应相关标志蛋白γH2AX(Ser139/Tyr142)水平。5.免疫共沉淀和蛋白质体外结合实验首次检测出SIRT2与SAMHD1蛋白存在相互结合。HEK293细胞给予DNA损伤刺激DOX(0.5μM),免疫共沉淀技术检测SIRT2与SAMHD1的结合。6.HEK293细胞给予SIRT2蛋白特异性抑制剂AGK2处理,蛋白质免疫印迹法检测SAMHD1蛋白乙酰化修饰水平和磷酸化修饰水平。7.稳转HEK293(shSIRT2)细胞给予DNA损伤刺激DOX(0.5μM),蛋白免疫印迹法检测SAMHD1磷酸化修饰水平和DNA损伤修复反应相关标志蛋白γH2AX(Ser139/Tyr142)水平。8.SIRT2过表达质粒转染HEK293细胞,给予DNA损伤刺激DOX(0.5μM),蛋白免疫印迹法检测SAMHD1磷酸化修饰水平和DNA损伤修复反应相关标志蛋白γH2AX(Ser139/Tyr142)水平。结果:1.SAMHD1蛋白可以被乙酰化修饰,其乙酰基转移酶是GCN5。2.给予DNA损伤刺激DOX(0.5μM),SAMHD1乙酰化修饰水平降低。3.给予HDAC抑制剂TSA和NAM处理,SAMHD1乙酰化修饰水平明显升高,并出现SAMHD1磷酸化修饰水平降低。4.转染K405R质粒的HEK293(Cas9-Samhd1)细胞的SAMHD1乙酰化修饰水平较转染WT质粒的HEK293(Cas9-Samhd1)细胞降低。给予DNA损伤刺激DOX(0.5μM),转染K405R质粒的HEK293(Cas9-Samhd1)细胞的SAMHD1磷酸化修饰水平较转染WT质粒的HEK293(Cas9-Samhd1)细胞降低,DNA损伤修复反应相关标志蛋白γH2AX(Ser139/Tyr142)较转染WT质粒的HEK293(Cas9-Samhd1)细胞升高,提示DNA损伤加重。5.SAMHD1和SIRT2在体内体外均可以互相结合。给予DNA损伤刺激DOX(0.5μM),两者结合增强。6.给予SIRT2蛋白特异性抑制剂AGK2处理,SAMHD1蛋白乙酰化修饰水平升高,磷酸化修饰水平降低。7.稳转HEK293(shSIRT2)细胞给予DNA损伤刺激DOX(0.5μM),SAMHD1的磷酸化修饰水平降低,DNA损伤修复反应相关标志蛋白γH2AX(Ser139/Tyr142)升高,提示DNA损伤加重。8.SIRT2过表达HEK293细胞,给予DNA损伤刺激DOX(0.5μM),SAMHD1的磷酸化修饰水平升高,DNA损伤修复反应相关标志蛋白γH2AX(Ser139/Tyr142)降低,提示DNA损伤减轻。结论:1.SAMHD1蛋白可被乙酰化修饰。2.DNA损伤压力下,SAMHD1蛋白乙酰化修饰可调控其磷酸化修饰,进而影响DNA损伤修复反应。3.去乙酰化酶SIRT2可能通过调控SAMHD1蛋白乙酰化修饰参与调控DNA损伤修复反应。