香菇是一种担子菌纲伞形科植物,也是目前世界上第二大食用菌,早在一千多年前就被收录入《本草纲目》中。现代医学发现,香菇具有抗肿瘤、抗氧化、保护肝脏、调节血压、防化学物质诱变和抗细菌真菌的多种功效。并且随着对香菇研究的日益深入,香菇多糖作为香菇中主要的活性成分也被发现,并将其增强免疫的功效进一步发掘。但作为大分子多糖的一种,香菇多糖还是存在着体内滞留时间短,代谢快,用药量大等缺点。碳纳米管是近来纳米材料研究的热点之一,其高比表面积,中空多孔结构,良好的生物膜穿透性,高化学稳定性等特性使得它在生物材料领域极具潜力,但原始碳纳米管的极低水溶性大大阻碍了其发展。本研究将碳纳米管作为载体,把香菇多糖以共价键的方式接枝在碳管上,从而增强碳纳米管的水溶性。然后研究香菇多糖碳纳米管在体外环境下对脾淋巴细胞活性和分化的影响,对树突状细胞抗原摄入,分化及细胞因子分泌的影响,以及作为佐剂增强细胞免疫和体液免疫的效果,旨在最终获得一种更好的免疫增强剂。本研究分为以下四个部分:试验Ⅰ香菇多糖碳纳米管的制备及其表征的测定用共价键修饰的方法将香菇多糖接枝于碳纳米管上,并对其进行表面特征的测定。首先,使用高分辨透射电镜对香菇多糖碳纳米管的微观形态进行观察和测定;其次,以傅里叶红外线光谱分析仪和紫外分光光度计检测香菇多糖与碳纳米管的连接方式;再次,用热重分析仪确定碳纳米管香菇多糖的接枝率;最后,用BCA试剂盒和粒径分析仪测定香菇多糖碳纳米管对OVA的吸附能力。结果显示,香菇多糖碳纳米管的直径平均在12nm,高于羧基碳纳米管的8nm,并且香菇多糖碳纳米管的外壁和内壁都有明显的附着物;紫外光谱的红移现象,红外光谱中香菇多糖碳纳米管伯醇峰的部分消失以及新峰的出现,证明香菇多糖与碳纳米管以酯键的方式连接;香菇多糖碳纳米管的热失重分析曲线显示香菇多糖的接枝率为9.1%;香菇多糖碳纳米管+OVA的Zeta电位为-26mV,高于香菇多糖碳纳米管的-23mV;BCA试剂盒结果显示每3重量的香菇多糖碳纳米管最多可吸附2重量的OVA。试验Ⅱ 香菇多糖破纳米管体外对小鼠脾脏淋巴细胞的影响为测定香菇多糖碳纳米管对细胞活性的影响,将3种浓度的香菇多糖碳纳米管及对应浓度的羧基碳纳米管和香菇多糖分别同时加入到体外分离的小鼠脾脏淋巴细胞中,用MTT法测定脾脏淋巴细胞活性的变化以及利用流式测定细胞表型的变化。结果表明,在低浓度情况下,三种药物对于细胞活性并不会产生显著影响,在中浓度时,香菇多糖碳纳米管与羧基碳纳米管一样,虽然不能够显著刺激淋巴细胞的增殖,但并不会对细胞活性产生抑制作用,而在高浓度下,两种碳管则表现出明显抑制活性的效果;细胞表型的对比显示出在体外环境下,羧基碳纳米管对于细胞免疫活性有一定的影响,而香菇多糖碳纳米管则未表现出明显差异。试验Ⅲ香菇多糖碳纳米管对小鼠骨髓树突状细胞的影响为了探讨香菇多糖碳纳米管对小鼠树突状细胞的影响,本试验祖细胞取自小鼠骨髓,并用rmG-CSF和rmIL-4将其诱导分化成树突状细胞(DCs)。将培养7天后的DCs用香菇多糖碳纳米管刺激48h后,检测细胞表面MHC-Ⅱ、CD80以及CD86的阳性表达率,以及细胞培养液上清中TNF-α、IL-1β、IL-12P70、IFN-y细胞因子的分泌量;将香菇多糖碳纳米管与FITC荧光标记的OVA混合12h,与培养7天后的DCs共同培养24h,用激光共聚焦显微镜检测香菇多糖碳纳米管对DCs吞噬抗原的影响。结果显示,香菇多糖碳纳米管不仅能显著提高DCs表面MHC-ⅡI、CD80以及CD86的表达,并且可以增强DCsTNF-α和IL-12P70的分泌,同时能够明显增加DCs的抗原摄入量。试验Ⅳ香菇多糖碳纳米管对OVA免疫小鼠的免疫应答的影响为探索香菇多糖碳纳米管对用OVA免疫的小鼠的影响,将192只4周龄的小鼠分为8组,分别以三种浓度的香菇多糖碳纳米管、羧基碳纳米管、香菇多糖、弗氏完全佐剂、PBS为佐剂的OVA以及PBS进行皮下免疫,隔周免疫共三周。于三免后第7、14、21、28d 摘眼球采血,采用 ELISA 法测定 IgG、IgG1、IgG2a、IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-y的浓度变化;每组小鼠扑杀4只,无菌取脾脏,分离脾脏淋巴细胞,采用MTT法测定脾脏淋巴细胞分别协同PHA和LPS时的增殖情况,并且在三免第7,21天后用流式的方法测定脾脏细胞中CD4+与CD8+表达并在终免第14天做组织切片对其进行组织学观察;在初免后的第1,2天取小鼠淋巴结测定其中树突状细胞表面CD80、CD86以及MHC-Ⅱ的表达。结果表明,香菇多糖碳纳米管体能够在某些时间点显著增加血清中IgG、IgG1、IgG2a、IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-y的浓度,在体内显著促进脾脏淋巴细胞增殖,并能对细胞免疫水平产生积极影响。综上可知,香菇多糖碳纳米管具有良好的佐剂活性。