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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的以妊娠母猪繁殖障碍和各年龄段猪呼吸道疾病为特征的烈性传染病,其给世界各国的养猪业带来巨大的经济损失。我们前期的研究结果表明,血红素加氧酶-1(HO-1)在体外能显著抑制PRRSV在宿主细胞中复制与增殖,但其分子机制仍不清楚。为阐明HO-1抑制PRRSV复制的分子机制,本研究在前期实验结果的基础上探讨了HO-1的下游代谢产物胆绿素(BV)、一氧化碳(CO)和铁离子(Fe2+)在介导HO-1抗病毒过程中的作用及相关分子机制。得到以下结果: 1.HO-1的下游代谢产物之一BV以浓度梯度依赖方式抑制PRRSV在Marc-145细胞和PAM中复制与增殖,其抗病毒活性具有PRRSV毒株非依赖性,并且BV对PRRSV粒子的感染性没有显著影响。BV和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)均显著降低PRRSV感染诱导的Marc-145细胞内活性氧自由基(ROS)的生成。然而,NAC不影响PRRSV的感染及复制,表明BV的抗病毒活性可能不依赖于其对PRRSV感染诱导的ROS的抑制作用。 2.利用胆绿素还原酶(BVR)特异性siRNA证明外源性BV在细胞内BVR的催化作用下转化为内源性胆红素(BR),从而发挥抗病毒作用。并进一步证明BR以一氧化氮(NO)依赖性方式抑制PRRSV在Marc-145细胞中复制与增殖。进一步的研究发现,BV或HO-1特异性诱导剂CoPP处理Marc-145细胞后均能促进胞内NO的产生,而NO特异性清除剂血红蛋白(Hb)能部分逆转BV或HO-1对PRRSV复制的抑制作用,并且可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)抑制剂ODQ和蛋白激酶G(PKG)抑制剂KT5823均部分逆转了HO-1、BV、BR和NO对PRRSV复制的抑制作用。上述结果表明,BV/BR通过NO依赖性cGMP/PKG信号通路抑制PRRSV在Marc-145细胞中复制与增殖。 3.Hb与CoPP共孵育细胞后,Hb部分逆转了HO-1对PRRSV复制的抑制作用,表明HO-1催化产生的内源性CO能部分介导HO-1的抗病毒活性。进一步利用外源性CO供体一氧化碳释放分子-2(CORM-2)证明CO剂量依赖性抑制PRRSV感染Marc-145细胞及PAM,并且CO能抑制PRRSV的细胞间传播,但其不影响PRRSV进入宿主细胞。 4.对CO体外抑制PRRSV复制的分子机制的研究表明,其能通过激活Marc-145细胞中cGMP/PKG信号通路抑制PRRSV在Marc-145细胞中复制。进一步的研究发现,CO能抑制NF-κB反应启动子活性,并且其通过抑制IκB降解及IκB磷酸化抑制PRRSV感染诱导的NF-κB活化,而抑制NF-κB激活能阻断PRRSV复制。因此,CO可能通过抑制NF-κB活化抑制PRRSV在Marc-145细胞和PAM中复制与增殖。此外,CO显著抑制PRRSV感染诱导的Marc-145细胞和PAM中促炎性细胞因子mRNA表达。 5.去铁胺(DFO)单独处理或与CoPP共同处理PRRSV感染的Marc-145细胞不能促进PRRSV的复制,表明内源性Fe2+对PRRSV复制没有显著影响;而使用外源性FeCl3处理细胞也不影响PRRSV的复制。上述结果表明HO-1的代谢产物Fe2+对PRRSV复制与增殖没有显著影响。 综上所述,当前的研究证实了HO-1的下游代谢产物BV和CO介导了HO-1的抗PRRSV效应,而两种代谢产物的抗病毒活性分别是由不同的下游分子机制介导的。本研究为我们深入理解氧化应激蛋白HO-1抑制PRRSV复制的分子机制提供了独特的视角,也为新型抗PRRSV药物或疫苗的开发提供了新的思路。