研究背景肺癌是一类常见的恶性肿瘤,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌总数的80%,临床确诊的患者大部分已存在局部的扩散或远处的转移,只有少数早期患者能接受根治性手术,复发率和转移率仍然较高。因此,亟待发展新的治疗理念、方法尤来治疗NSCLC患者,以延长生存期。青蒿素(Artemisinin,ARS)是从复合花序植物黄花蒿中分离得到抗疟疾的有效单体,由我国科学家屠呦呦在1971年发现,其衍生物包括蒿甲醚(Artemether,ARM)、蒿乙醚(Arteether)、双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)和青蒿琥酯(Artesunate,ART)等,它们均含有过氧桥结构,属于倍半萜内酯化合物。ARS类药物是继乙氨嘧啶、氯喹、伯喹之后的抗疟特效药,具有毒性低、抗疟疾作用强的特点,是在世界范围内治疗脑型疟疾和抗氯喹疟疾的首选药物。ARS的抗疟疾作用机制比较明确,涉及抑制血红素内化、二价铁离子依赖的自由基和活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生以及细胞内钙离子水平增加。相对而言,ARS抗肿瘤的作用机制目前尚不清楚,多数学者认为与其抗疟疾的作用机制相类似,即诱导产生大量的活性氧是ARS类药物抗肿瘤的最终效应分子。已知ARS类药物在二价铁存在的情况下能对肿瘤细胞产生毒性作用,而且肿瘤细胞内含有高浓度的二价铁;二价铁催化ARS类化合物的过氧桥断裂,产生大量自由基和ROS,导致肿瘤细胞膜破坏和细胞内物质外漏,最终对肿瘤细胞产生毒性。然而抗肿瘤药物的抗肿瘤作用不仅局限于它的细胞毒性作用,有研究发现较低浓度的ARS类药物可以诱导细胞凋亡。课题组成员研究发现,ARS对肺癌有较强的生物学活性,不仅可直接作用于淋巴管内皮细胞、抑制肿瘤相关的淋巴管生成、淋巴结转移和远处转移,而且显著抑制肿瘤侵袭、转移相关分子的表达,但ARS抗肿瘤转移的具体分子机制还不清楚。因此,ROS依赖的机制并不能全面解释ARS类药物的抗肿瘤药理学作用,尤其是抗肿瘤血管生成、淋巴管生成和肿瘤转移,其他非ROS依赖的机制可能参与其中。HuR人抗原R(human antigen R,HuR)是一种广谱mRNA结合蛋白,属于胚胎致死性异常视觉(embryonic lethal abnormal vision,ELAV)家族,在多种细胞和组织中广泛表达,并通过RNA识别基序(RRM)与多种mRNA 3’端未翻译区(3’UTR)的富含AU碱基的序列(ARE)结合,增加mRNA的稳定性,使mRNA从胞核转运至胞浆的过程中保护mRNA免受核酸酶降解。除了多种分子的mRNA,HuR还具有结合并调节微小RNA(miRNA)和长链非编码RNA(lncRNA)的功能。HuR涉及心血管,神经系统和肌肉系统的慢性炎症和病变。正常情况下,HuR主要表达在细胞核,但在不同应激条件下,如药物、激素、低氧、细胞因子刺激,可在细胞核和细胞浆之间穿梭,导致胞浆中的HuR蛋白量增高,激活的多种信号通路改变了HuR的亚细胞定位或直接改变HuR的表达水平,HuR再通过RRMs与靶mRNA的ARE和其它反式作用因子结合,从细胞核转运到细胞浆,并改变RNA的空间结构、抑制脱腺苷化、抑制mRNA募集至外切酶体或阻断可识别ARE的核酸内切酶的活性,继而改变mRNA的稳定性、影响目标蛋白的表达。基质金属蛋白酶(MMP)-9(IV型胶原酶;明胶酶B),是分解细胞外基质的最重要的酶之一,在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中起关键作用。趋化因子受体是一类具有跨膜结构的G蛋白偶联受体,能与其特异性配体结合,参与恶性肿瘤的增殖和转移。已知HuR、MMP-9、CXCR4在NSCLC中表达显著高于正常肺组织。我们前期结果显示胞浆HuR阳性参与与肿瘤进展、淋巴结转移。我们提出设想HuR参与了MMP-9、CXCR4的转录后调控,参与肿瘤血管和淋巴管生成、肿瘤生长和转移等。基于目前国内外研究现状,结合课题组前期对HuR蛋白参与肺癌生长和转移、ARS及其衍生物抗肿瘤的研究基础,本课题假设:ARS及其衍生物抗NSCLC转移作用机制涉及非ROS通路;ARS通过激活相关激酶信号对HuR表达进行修饰,抑制了HuR的胞核-胞浆转运或直接影响蛋白表达,继而影响下游肿瘤相关分子的表达,最终抑制肿瘤生长和转移。研究目的在前期研究和国内外相关研究基础上,继续探究ARS类药物在对抗NSCLC转移的分子机制,为ARS类药物抗肿瘤作用提供依据。研究内容本课题分三部分进行研究。第一部分青蒿素及其衍生物对NSCLC肺癌细胞的增殖、侵袭的影响。首先进行CCK-8实验,不同药物浓度的ARS类药物干预A549、95D和H1975细胞,计算IC50,验证ARS类药物对肿瘤细胞的增殖的影响。然后进行Transwell小室实验,不同浓度ART干预细胞,观察细胞侵袭能力的变化。最后设计合理药物浓度,ART干预细胞后,用RT-PCR、Western blot观察ART对NSCLC细胞抗增殖、侵袭和血管生成等相关mRNA、蛋白表达的影响。第二部分HuR参与NSCLC增殖、侵袭的机制研究。首先,用siHuR瞬时转染A549细胞24小时后,CCK-8实验方法观察细胞活力情况。然后用siHuR瞬时转染A549细胞24小时后,进行Transwell小室实验,观察HuR降低情况对细胞侵袭能力的影响。最后用siHuR瞬时转染A549细胞24小时后,用RT-PCR、Western blot观察ART对NSCLC细胞抗增殖、侵袭和血管生成等相关mRNA、蛋白表达的影响。第三部分青蒿素类药物通过HuR影响NSCLC生物学功能的分子机制研究。A549、95D细胞经ART不同浓度处理后,用激光共聚焦显微镜观察HuR亚细胞定位,用Western blot定量分析HuR细胞质、细胞核表达情况;用放线菌素D(Actinomycin D,ActD)处理细胞后,分析ART对转移相关基因mRNA降解的影响。结果第一部分青蒿素及其衍生物对NSCLC肺癌细胞的增殖、侵袭的影响。1.ARS及其衍生物抑制3种NSCLC细胞的增殖,在A549细胞上,ARS、ART、DHA的IC50值分别为:2013.91μg/ml、105.77μg/ml、76.44μg/ml。在95D细胞上,ARS、ART、DHA的IC50值分别为:1304.66μg/ml、66.89μg/ml、61.81μg/ml。在H1975细胞上,ARS、ART、DHA的IC50值分别为:1889.68μg/ml、94.34μg/ml、90.77μg/ml。与A549、H1975相比较,95D细胞对ARS及其衍生物较敏感;针对同一种肺癌细胞株,ART、DHA的IC50值相对于ARS小。2.40μg/mlART组作用于A549细胞后,细胞穿膜细胞数目少于0μg/mlART组[(12.0000±2.0000)vs(32.6667±2.51661),t=-11.136,P<0.05]。90μg/ml ART组作用于A549细胞后,细胞穿膜细胞数目少于40μg/ml ART组[(5.333±0.55535)vs(12.0000±2.0000),t=-5.547,P<0.05]。细胞穿膜数目与ART用药剂量呈负相关,ART抑制A549细胞的侵袭能力在一定浓度范围内呈正相关。3.40μg/mlART作用于A549细胞组,CXCR4的蛋白表达水平明显低于0μg/mlART组[(0.4763±0.01658)vs(0.7408±0.06384),t=-6.945,P<0.05]。ART抑制A549细胞CXCR4的mRNA表达水平在一定浓度范围内呈正相关。第二部分HuR参与NSCLC增殖、侵袭的机制研究。1.HuR siRNA处理的A549细胞的HuR mRNA水平明显低于阴性对照组[(0.8862±0.09870)vs(2.4225±0.13347),t=-16.029,P<0.01]。HuR siRNA处理的A549细胞的HuR蛋白水平明显低于阴性对照组[(0.5227±0.04638)vs(0.9475±0.06127),t=-9.574,P<0.01]。2.HuR siRNA处理的A549细胞的MMP-9的mRNA水平明显低于阴性对照组[(0.6131±0.34299)vs(1.0868±0.35277),t=-5.157,P<0.05]。HuR siRNA处理的A549细胞的MMP-9蛋白水平明显低于阴性对照组[(0.0682±0.02903)vs(0.4654±0.13072),t=-5.138,P<0.05]。3.HuR siRNA处理的A549细胞的CXCR4的mRNA水平明显低于阴性对照组[(0.6629±0.29973)vs(1.6367±0.45143),t=-3.113,P<0.05]。HuR siRNA处理的A549细胞的CXCR4蛋白水平明显低于阴性对照组[(0.1301±0.00199)vs(0.7147±0.00752),t=-130.132,P<0.01]。4.HuR siRNA转染的细胞增殖能力比阴性对照组低(两组间比较(每天)用独立样本t检验,P<0.05)。5.HuR siRNA降低A549细胞的侵袭能力[(10.6670±2.08167)vs(27.6667±2.08167),t=-10.002,P<0.05]。第三部分青蒿素类药物通过HuR影响NSCLC生物学功能的分子机制研究。1.HuR siRNA转染的细胞,ART抑制增殖能力比阴性对照组高(两组间比较(每天)用独立样本t检验,P<0.05)。2.ART降低HuR的mRNA、蛋白水平表达不明显。3.激光共聚焦结果显示,ART抑制HuR的细胞质分布,成剂量依赖性。4.wb结果显示,ART能降低HuR的细胞质分布,呈剂量依赖性。5.ActD实验结果显示,ActD存在的情况下,CXCR4、MMP-9的mRNA随着时间的增加降低。ART实验组显示40ug/ml浓度的ART在4h以内,CXCR4、MMP-9的mRNA与对照组相比,降低趋势明显。4h以后MMP-9的mRNA呈相对增高趋势,在24h的结果显示ART不降低MMP-9的相对表达水平。结论1.ARS及其衍生物抑制NSCLC细胞的增殖和侵袭,在转录后水平对MMP-9、CXCR4基因表达产生抑制作用,减少CXCR4的mRNA水平、蛋白水平。2.HuR敲低能降低CXCR4、MMP-9的mRNA水平、蛋白水平。3.ART低浓度情况下,ART不降低HuR的mRNA和蛋白水平,但是改变HuR的细胞核-细胞质转运。ART在转录后水平影响MMP-9、CXCR4 mRNA表达。4.青蒿琥酯为代表的青蒿素类药物,抑制了HuR的细胞核-细胞质转运,继而在转录后水平影响下游CXCR4、MMP-9的mRNA稳定性,降低CXCR4的蛋白表达,抑制NSCLC细胞的增殖和侵袭。