水稻褐飞虱诱导型启动子的鉴定及克隆

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水稻是全世界特别是亚洲人口所必需的粮食作物之一。其虫害控制一直是水稻育种研究的重点,随着转基因技术应用的不断发展,启动子作为基因工程中表达载体构建的重要组成部分也受到重视。它可以调控基因表达的位置、时期与强度。目前,在一些天然的水稻种质资源中已经克隆或鉴定了一些褐飞虱抗性相关的基因,利用水稻褐飞虱诱导型启动子,对一些褐飞虱抗性基因驱动表达,可以在褐飞虱取食的情况下,有效的提高这些抗性基因在转录水平的表达,避免其组成型表达而过度消耗细胞内的物质和能量,可使转基因水稻的抗褐飞虱性能增强,且品质和生物安全性得以改善。鉴于上述情况,本研究的目的是分离克隆水稻全基因组中褐飞虱诱导型启动子,使其成为转基因抗虫育种的有效工具,本研究取得以下结果:1.以本室李昌焱等褐飞虱接种水稻的芯片数据及本实验室水稻全生育期基因表达谱芯片数据为基础,经过RT-PCR验证后挑选了8个在绿色组织特异性表达,胚乳中不表达或表达量低,同时受褐飞虱取食诱导上调表达的基因,利用PCR法以褐飞虱敏感品种TN1或褐飞虱高抗品种RH的基因组为模板分离克隆了这些基因上游的启动子,分别命名为PTG1、PRG2、PTG3、PTG4、PRG4、PRG6。2.将这8个启动子分别连入DX2181b载体GUS报告基因上游,并驱动其表达,将终载体转化至粳稻品种中花11中,PTG5和PRG6在分化中,对启动子PTG1、PTG2、PTG3、pTG4、PRG1、PRG4转基因植株进行PCR阳性检测以及拷贝数检测。转基因阳性植株经褐飞虱取食及JA处理后,通过定量RT-PCI澈术检测GUS因的表达量,找到3个具有良好应用价值的启动子分别为PTG3、PRG1、PRG4。3.PTG3的诱导性不受水稻品种基因型限制,受褐飞虱取食最高上调4.38倍,茉莉酸处理后最高上调3.17倍;本底表达量较高,GUS染色变化明显,为绿色组织特异型启动子。4.PP.G1在褐飞虱接种芯片数据中,该基因在高抗品种RH中上调97倍;RT-PCR的基因表达检测中,褐飞虱高抗品种RH中上调968倍;受褐飞虱危害诱导最高上调140.50倍,而茉莉酸处理诱导也有轻微上调;本底表达量低,GUS染色无变化。5.PRG4诱导性不受水稻品种基因型限制,受褐飞虱取食诱导最高上调22.08倍,茉莉酸处理诱导最高上调4.46倍,具有一定组织特异;本底表达量低,GUS染色变化明显。综上所述,利用褐飞虱诱导型启动子可以在特定时期诱导抗褐飞虱基因表达,对高效的抗虫、抗病、育种、减少化学污染以及提高农作物的产量,具有重要意义和应用价值。并对相关启动子和基因提供良好的研究资源。
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