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H5亚型禽流感(AI)给我国的养禽业造成了严重的经济损失,而疫苗免疫是防控该病的重要手段。血凝素(HA)是禽流感病毒(AIV)诱导宿主产生中和抗体最重要的保护性抗原,然而HA基因容易发生突变,导致近年来我国H5亚型AIV出现多个流行分支,因此开发免疫效果好的多价H5亚型禽流感疫苗对于有效防控该病具有重要意义。鸡痘病毒(FPV)具有多个复制非必需区,是构建表达H5亚型不同分支HA基因重组疫苗的理想载体。目前,虽然同一复制非必需区插入多个HA的重组鸡痘疫苗已有报道,但该型疫苗免疫效果的提高仍然有限。我们也可在不同复制非必需区插入不同的HA基因构建多价疫苗,而复制非必需区的筛选可能是影响重组鸡痘疫苗免疫效果的关键。因此,本研究构建了复制非必需区(FPV34)表达HA基因的重组鸡痘疫苗,并与其它插入位点(FPV12)的重组鸡痘病毒进行了生长特性、HA转录及蛋白表达水平以及免疫效力的比较研究,旨在为多价H5亚型禽流感重组鸡痘疫苗的研制奠定一定的基础。1表达H5亚型AIV HA基因重组鸡痘病毒的构建将PCR扩增的鸡痘病毒复制非必需区片段FPV3和FPV4克隆至pBluescript SK(-)载体,得到载体pSKP3P4;然后将从质粒pFG1175-1酶切下来的标记基因表达框P11-LacZ和从质粒P12LS酶切下来的启动子Ps分别克隆至载体pSKP3P4,得到转移载体p34xLs;最后将H5亚型AIVSY株(clade 2.3.4)和W6-7株(clade 7.2)的HA基因分别插入转移载体p34xLS中Ps启动子下游,获得转移载体p34xLs-SYHA和p34xLs-W6-7HA。用脂质体法转染已感染FPV的CEF,利用蓝白斑筛选获得纯化的表达HA基因的重组鸡痘病毒rFPV34-SYHA和rFPV34-W6-7HA。提取重组病毒的基因组DNA,分别扩增HA基因,证明目的基因成功插入鸡痘病毒基因组；免疫荧光试验表明HA基因能够在重组鸡痘病毒中正确表达。2不同插入位点重组鸡痘病毒的生长特性、HA转录和蛋白表达水平的比较重组鸡痘病毒rFPV12-SYHA和rFPV34-SYHA分别感染鸡胚成纤维细胞(CEF),首先测定各病毒的效价及生长曲线。其次,运用相对荧光定量PCR的方法检测以上两株重组病毒HA基因在CEF细胞中的转录水平。最后,采用ELISA比较重组病毒外源基因的蛋白表达水平。生长曲线的结果表明两株重组病毒rFPV12-SYHA和rFPV34-SYHA在生长特性方面类似；相对荧光定量PCR的结果表明了它们在HA基因转录水平方面没有显著差异；ELISA数据则证明了rFPV12-SYHA和rFPV34-SYHA在表达HA蛋白方面没有显著差异。3表达H5亚型AIVHA基因重组鸡痘病毒免疫效力试验10日龄SPF鸡随机分组,分别免疫rFPV12-SYHA、rFPV34-SYHA、rFPV34-W6-7HA和wt-FPVLP,剂量为105PFU/只,同时设H5亚型AI油乳剂灭活苗对照组和PBS对照组,剂量为0.2 mL/只。在免疫后7d、10d、14d、17d和21d分别采集外周血,检测HI抗体效价。结果显示,各重组病毒均能够诱导产生一定水平的HI抗体,但均显著低于灭活油苗组(P<0.05)。免疫后21 d,分别用相应的母本SY株和W6-7株进行攻毒,攻毒剂量均为105EID50,随后观察各疫苗对鸡的免疫保护效果,采集喉拭子和泄殖腔拭子并测定排毒情况。结果表明,针对AIVSY株攻击,rFPV12-SYHA和rFPV34-SYHA免疫组的攻毒保护率为85%,而免疫灭活油苗SY组的保护率为95%；针对AIV W6-7株攻击,rFPV34-W6-7HA免疫组的保护率为90%,灭活油苗W6-7免疫组的保护率同样为90%。综上所述,在不同复制非必需区(FPV12和FPV34)表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒,其生长特性、基因的转录水平、蛋白的表达水平和免疫保护效力类似；证明了这两个复制非必需区均可作为外源片段的插入区,这为研制H5 AIV多价疫苗奠定了基础。