杨树D1亚类周期蛋白基因Poptr;CYCD1;5的功能研究

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植物的D类细胞周期蛋白主要调控细胞周期G1/S期的转换过程,在细胞的分裂过程中具有重要的作用。本研究以杨树D1亚类周期蛋白基因Poptr; CYCD1;5作为研究对象。  从小黑杨(Populus simonii×P.nigra)中克隆Poptr;CYCD1;5启动子并构建表达载体pPoptr;CYCD1;5∷GUS,通过农杆菌(Agrobacterium)介导侵染拟南芥(Arabidopsis thaliana)并结合GUS染色技术分析Poptr;CYCD1;5启动子的特性,结果表明gus主要集中在叶的维管组织和根基中表达,说明Poptr;CYCD1;5启动子具有组织特异性。利用生物信息学数据库分析Poptr;CYCD1;5启动子,结果发现Poptr;CYCD1;5启动子除了含有一些基本元件外还含有应答光的元件、应答激素的元件,说明Poptr;CYCD1;5启动子不但具有组织特异性还具有光诱导和激素诱导的活性。  利用生物信息学数据库分析Poptr;CYCD1;5的cDNA,结果发现Poptr;CYCD1;5的开放阅读框全长为930bp,共编码309个氨基酸,该基因编码的蛋白分子量约为34.5kDa,等电点为8.18。此外,还含有一个细胞周期蛋白盒和一个近N端与Rb结合的基本序列LxCxE(x代表任一氨基酸)。  从小黑杨中克隆Poptr; CYCD1;5的cDNA,并构建表达载体35S∷Poptr;CYCD1;5,通过农杆菌介导侵染烟草(Nicotiana tabacum)叶片。用PCR、Northern杂交检测转基因烟草,结果表明Poptr;CYCD1;5已整合到烟草基因组中,并能够在RNA水平上表达。通过对转基因烟草植株在细胞学、解剖学、形态学等指标的观察,发现在转基因烟草中,Poptr;CYCD1;5的过表达影响了植物的生长发育、叶的形态建成、花的形态建成。用环境扫描电镜观察转基因烟草花粉的表型,FDA染色检测转基因烟草花粉的活力以及DAPI染色观察转基因烟草四分体时期的花药。结果表明,Poptr; CYCD1;5与植物的减数分裂有关,该基因的过表达导致花粉发育异常,致使转基因烟草高度不育。
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