论文部分内容阅读
研究背景:丙氨酸氨基转移酶是人血清中的一种重要的催化酶,在蛋白质分解代谢中起氨基转移作用。它主要存在于肝细胞浆内,肝细胞损伤时,大量的ALT释放入血,所以丙氨酸氨基转移酶是反映肝损伤的敏感的指标。为减少输血传播疾病的发生,我国卫生部规定,血清ALT检验是献血员健康体检必查项目之一,而我国每年由于ALT不合格造成的采血后血液报废率达6-8%。面对现在街头无偿献血者因血清ALT高造成大量不必要的献血和血液浪费问题,非常有必要建立一种快速灵敏、准确方便的ALT检测方法。目前街头献血者ALT的筛查均采用速率法和化学干粉法。但这两种方法存在的主要问题是反应时间长,需要特殊设备,受环境因素影响大。免疫金标法具有操作简便、快速、特异性强,不需要特殊设备,易观察结果等优点,因此我们探索ALT免疫金标快速检测试剂的研制,而高特异性抗ALT单克隆抗体的制备是该试剂研制的关键步骤。目的:获得分泌高特异性抗ALT单克隆抗体的杂交瘤细胞株;制备针对ALT的单克隆抗体并对其特性进行鉴定。方法:用含50%福氏佐剂的猪ALT纯品（20μg）腹部皮下免疫Balb/C小鼠,共4次,免疫间隔为2周。间接ELISA法测抗体效价。取效价满意鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合,用含HAT和HT的培养液选择性培养,用高ALT人血清作检测原,采用间接ELISA法测定培养上清中抗体分泌情况,阳性孔经三次有限稀释法克隆化,得到的阳性杂交瘤细胞株腹腔接种于预注射降植烷的Balb/C小鼠,收集腹水,用正辛酸-硫酸铵沉淀法进行纯化。采用间接ELISA法测定腹水中效价和亲和力;秋水仙素阻断法进行杂交瘤细胞染色体分析;用Southern Biotech公司的单克隆抗体亚类鉴定试剂鉴定单抗亚类;SDS-PAGE电泳测定单抗的分子量;用Western blotting分析单克隆抗体的特异性;将纯化后单抗用辣根过氧化物酶标记,建立双抗体夹心ELISA检测人血清中的ALT的方法。结果:采用传统的细胞融合技术得到1株分泌抗人ALT单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其染色体数目为95～106。其分泌的抗体为IgG1,轻链为κ型。上清和腹水中抗体效价分别为10-4和10-6。SDS-PAGE显示该抗体在55KD和25KDWestern blotting结果显示该株McAb可与人血清中的ALT特异地结合。人血清标本和ALT质控品的双抗体夹心ELISA结果和生化分析仪结果基本一致。结论:本研究获得了一株能稳定分泌ALT单克隆抗体特异性的杂交瘤细胞株,该株单抗有很好的亲和力,能特异性地识别人血清中的ALT,而与血清中的其它蛋白无交叉反应。本研究为建立ALT的免疫金标检测方法提供了很有价值的试验工具。