研究目的矽肺是世界范围内最主要的职业病,尽管各国不断在改进预防矽肺的方法,但无论在发达国家还是在中低收入国家,每年仍然有大量的新发病例。二氧化硅（Si O₂）在肺组织中的沉积是矽肺的主要致病原因。Si O₂进入肺部后所引起的肺纤维化病变是不可逆的,患者因此而导致肺功能逐渐下降乃至衰竭。迄今国内外均没有针对矽肺纤维化特殊的治疗药物和措施。因此,研究矽肺的发病机制,进行中医药的相关探索,为治疗矽肺另辟蹊径非常重要。大黄?虫丸是《金匮要略》中的经典名方,我们的前期预实验表明,它对于小鼠矽肺纤维化有改善作用。本研究通过动物实验和细胞实验,由TGF-β1/Smad信号通路入手,从整体、细胞和分子水平揭示大黄?虫丸治疗矽肺纤维化的作用机制。研究方法第一部分:小鼠矽肺纤维化模型造模方案的确定将80只SPF级昆明种小鼠随机分为正常对照组、暴露气管注射组、气管插管组、鼻腔滴入组和静式染毒组,共5组,每组16只,其中正常对照组不做任何干预。第1-4组一次性造模后第40天,第5组连续造模40天,比较各组小鼠体重、肺脏系数、存活率、肺组织病理情况,综合确定实验造模方案。第二部分:大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠的作用机制研究小鼠共108只,其中90只用静式染毒法造模40天后随机分成模型对照组、汉防己甲素组、大黄?虫丸高、中、低剂量组5组,每组18只。不染毒小鼠18只为正常对照组。低、中、高剂量组按照临床大黄?虫丸成人等效剂量的1倍、1.5倍和3倍剂量灌胃给药,一日一次。汉防己甲素按照临床成人等效剂量一天一次灌胃给药;正常对照组和模型对照组每次灌胃等量生理盐水。分别在给药后14、21、28天每组各处死6只小鼠,计算肺脏系数,取血清检测TNF-α、IL-6、IL-1β、HYP的含量,并用HE、Masson染色观察病理改变,用Western-Blot法检测大黄?虫丸对TGF-β1/Smad通路相关蛋白（TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3、Smad7）表达的影响,用RT-PCR法检测大黄?虫丸对TGF-β1/Smad通路相关基因（TGF-β1m RNA、Smad2m RNA、Smad3m RNA、Smad7m RNA）表达的影响。第三部分:大黄?虫丸对Si O₂诱导的矽肺纤维化体外细胞模型作用机制研究用Si O₂诱导MH-S细胞构建矽肺纤维化细胞模型,提取大黄?虫丸大鼠含药血清,采用串联质谱法检测血清中主要药理成分,再用不同浓度的含药血清干预,观察细胞形态,用CCK8法检测细胞活性、Elisa法检测细胞上清TNF-α、IL-6、IL-1β的含量、Western-Blot法检测含药血清对TGF-β1/Smad通路相关蛋白（TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3、Smad7）表达的影响,通过免疫荧光染色法观察以上蛋白的表达。研究结果第一部分:将静式染毒法作为本实验的造模方法1 各组一般情况正常对照组一般情况正常。各造模组小鼠后期体重增长缓慢,明显低于正常对照组,皮毛稀疏缺乏光泽,污秽粘连。静式染毒组小鼠时有挠鼻现象,可见鼻尖、嘴唇暗紫。2各组存活率及肺脏系数比较正常对照组为100%,暴露气管注射组为62.5%、气管插管组为87.5%,鼻腔滴入组为93.8%,静式染毒组为100%,静式染毒组明显高于其余三组。各模型组小鼠肺脏系数与正常组相比,均具有显著性差异（P<0.01）。3各组肺组织病理结果肺组织HE染色结果:正常对照组肺泡结构正常。各造模组均可见部分肺泡腔萎陷,局部肺泡上皮细胞变性坏死,胞核固缩。其中,暴露气管注射组、气管插管组及静式染毒组肺间质不同程度的增厚,伴纤维组织增生和新生上皮细胞增生,炎细胞浸润,主要为圆形深染的淋巴细胞。Masson染色结果显示,正常对照组肺组织形态无明显改变。四个模型组小鼠肺泡结构破坏,肺泡间隔增宽,肺野内见大量密集的弥漫性蓝色胶原纤维增生,呈片状或束状分布。4本部分实验结论综上,暴露气管注射法、气管插管法、静式染毒法三种方式皆可以成功复制小鼠矽肺弥漫性纤维化模型,鼻腔滴入法相对成功率低,这可能是因为小鼠经鼻滴最终进入食道而未进入呼吸道所致。综合造模方法和真实疾病形成的拟合程度、成功率、存活率等相关因素,实验选取静式染毒法作为造模方法。第二部分:大黄?虫丸能够通过调控TGF-β1/Smad通路抑制小鼠矽肺模型的肺纤维化进程1大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠一般情况的影响结果造模期间,正常组小鼠一般情况状态良好。模型组小鼠精神逐渐萎靡,时有挠鼻现象,活动减少,体重增加不明显,皮毛稀疏缺乏光泽,污秽粘连,鼻尖、嘴唇较正常组偏暗,部分尾部可见散在紫色血丝。给药后大黄?虫丸高剂量组精神状态良好,接近正常组,中剂量组与模型组相比情况有改善,低剂量组总体情况不如高、中组,但优于模型组。2 大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠肺脏系数的影响结果肺脏系数:模型组显著高于正常组（P<0.01）;在给药14天后,可见大黄?虫丸高剂量组低于模型组,有统计学意义（P<0.05）;给药21天后,大黄?虫丸高、中剂量组显著低于模型组（P<0.01）。28天后,高、中、低组均显著低于模型组（P<0.01）。3 大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠肺组织病理染色的影响结果肺组织病理结果:HE染色:正常对照组肺泡形态结构正常;模型组组织充血,肺泡的萎陷、融合,上皮细胞变性坏死,胞核固缩。不同程度的肺泡间隔增厚,纤维组织增生或上皮细胞增生;以及局部淋巴细胞浸润。大黄?虫丸高剂量组肺组织形态结构改善明显,最接近正常组。Masson染色:正常对照组未见明显的蓝染胶原沉积;模型组可见弥漫性蓝染的胶原纤维,肺泡壁厚薄不一;大黄?虫丸治疗后,不同程度地减少了肺组织中胶原纤维沉积,其中以大黄?虫丸高剂量（1.170 g/kg）改变最为明显,蓝染颜色明显变浅,面积也明显减少。两种染色方法都说明大黄?虫丸高剂量组对肺组织炎症和纤维化有明显的改善作用。4 大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠细胞因子的影响结果模型组小鼠血清中HYP、TNF-α、IL-6、IL-1β含量均显著高于正常组（P<0.01）。14天时,大黄?虫丸高、中剂量组HYP、TNF-α、IL-6、IL-1β显著低于模型组（P<0.01）,低剂量组TNF-α、IL-6也显著低于模型组（P<0.01）。21天时,大黄?虫丸高剂量组HYP、TNF-α、IL-6、IL-1β显著低于模型组（P<0.01）;中剂量组HYP、IL-6、IL-1β均显著低于模型组（P<0.01）;低剂量组IL-1β的含量显著低于模型组（P<0.01）。28天时,大黄?虫丸高剂量组HYP、TNF-α、IL-6、IL-1β含量均显著低于模型组（P<0.01）,中剂量组的IL-1β也显著低于模型组（P<0.01）。5 大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠TGF-β1/Smad通路蛋白表达的影响结果模型组TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3蛋白含量与正常组相比显著增加（P<0.01）,Smad7显著降低（P<0.01）。14天时,大黄?虫丸高剂量组TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3的蛋白含量较模型组显著降低（P<0.01）,Smad7显著增加（P<0.01）。大黄?虫丸中剂量组Smad2较模型组显著降低（P<0.01）,α-SMA、Smad3较模型组降低,有统计学意义（P<0.05）;Smad7显著增加（P<0.01）。低剂量组Smad2蛋白含量较模型组显著降低（P<0.01）,Smad7显著增加（P<0.01）。21天时,除低剂量组的Smad2低于模型组,具有统计学意义外,其余大黄?虫丸高、中、低剂量组的TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3蛋白含量较模型组显著降低（P<0.01）,Smad7显著增加（P<0.01）。28天时,大黄?虫丸高剂量组TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3蛋白含量较模型组明显降低,Smad7明显增加,其中TGF-β1、Smad2与模型组的差异具有统计学意义（P<0.05）,其余三个指标差异均显著（P<0.01）。大黄?虫丸中、低剂量组Smad3的蛋白含量较模型组显著降低（P<0.01）,Smad7显著增加（P<0.01）。6 大黄?虫丸对矽肺纤维化小鼠TGF-β1/Smad通路基因表达水平的影响结果模型组Smad2m RNA在14天、21天,Smad3m RNA在14天表达水平高于正常组,具有统计学意义（P<0.05）;Smad7m RNA在21天表达水平低于正常组具有统计学意义（P<0.05）。其余各时间段模型组TGF-β1m RNA、Smad2m RNA、Smad3m RNA表达水平显著高于正常组（P<0.01）,Smad7m RNA表达水平均显著低于正常组（P<0.01）。14天时,大黄?虫丸高剂量组与模型组相比,Smad2m RNA、Smad3m RNA降低（P<0.05）,TGF-β1m RNA降低（P<0.01）,Smad7m RNA升高（P<0.01）。中、低剂量组TGF-β1m RNA较模型组显著降低（P<0.01）,Smad7m RNA显著升高（P<0.01）。中剂量Smad2m RNA较模型组降低,有统计学意义（P<0.05）。21天时,高剂量组TGF-β1m RNA、Smad3m RNA表达水平与模型组相比显著降低（P<0.01）,Smad2m RNA表达比模型组低（P<0.05）,Smad7m RNA表达比模型组高（P<0.05）。中、低剂量组TGF-β1m RNA、Smad3m RNA显著低于模型组（P<0.01）。28天时,大黄?虫丸高、中、低剂量组TGF-β1m RNA、Smad2m RNA、Smad3m RNA明显降低,与模型组相比均具有显著性差异（P<0.01）;Smad7m RNA的表达水平明显升高,同样与模型组相比具有显著性差异（P<0.01）。第三部分:大黄?虫丸含药血清能够通过调控TGF-β1/Smad通路抑制体外细胞的纤维化水平1大黄?虫丸含药血清对Si O₂诱导的MH-S细胞活力的影响结果经过Si O₂混悬液刺激细胞后,细胞活力明显下降（P<0.05）。大黄?虫丸不同浓度干预后,细胞活力均高于模型对照组,且呈浓度依赖性。2大黄?虫丸含药血清对Si O₂诱导的MH-S细胞因子的影响结果模型对照组细胞上清TNF-α、IL-6、IL-1β的含量显著高于正常对照组（P<0.01）,大黄?虫丸含药血清15%组及含药血清10%组的IL-6含量显著低于正常对照组（P<0.01）,含药血清15%组的TNF-α及IL-1β含量低于模型组,有统计学意义（P<0.05）。含药血清10%组的TNF-α含量低于模型组,有统计学意义（P<0.05）。3大黄?虫丸含药血清对Si O₂诱导的MH-S细胞系TGF-β1/Smad通路蛋白表达的影响结果（1）Western-Blot结果:模型对照组TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3蛋白表达显著高于正常对照组（P<0.01）,Smad7表达相反,模型对照组低于正常组,且具有统计学意义（P<0.05）。大黄?虫丸含药血清15%组的TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3蛋白表达显著低于模型对照组（P<0.01）,Smad7蛋白表达相反,高于模型组,有统计学意义（P<0.05）。含药血清10%组的TGF-β1、α-SMA、Smad2蛋白表达显著低于模型对照组（P<0.01）。含药血清5%组α-SMA蛋白表达显著低于模型对照组（P<0.01）,TGF-β1、Smad2的蛋白表达低于模型组,具有统计学意义（P<0.05）。（2）细胞免疫荧光结果:从细胞免疫荧光的结果可以看出,模型对照组TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3表达的平均光密度值（average optical,AO）,显著高于正常对照组（P<0.01）,Smad7表达的AO值低于正常对照组（P<0.01）。加入大黄?虫丸含药血清后,15%含药血清组的TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3的AO值显著低于模型对照组（P<0.01）,Smad7的AO值明显高于模型对照组（P<0.01）;10%含药血清组TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3的AO值显著低于模型对照组（P<0.01）,Smad7表达的AO值高于模型对照组,有统计学意义（P<0.05）;5%含药血清组α-SMA、Smad2的AO值显著低于模型对照组（P<0.01）,TGF-β1、Smad3的AO值低于模型对照组,有统计学意义（P<0.05）,Smad7表达的AO值显著高于模型对照组（P<0.01）。说明大黄?虫丸能够明显降低TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3的AO值,同时增强Smad7的AO值,尤其是15%含药血清组的效果更加明显,结论同Western-Blot相一致。研究结论1、通过造模实验研究,显示暴露气管注射法、气管插管法和静式染毒法三种方式皆可以成功复制小鼠矽肺纤维化模型,但是为了减少造模过程中创伤的影响,降低小鼠的死亡率,更加贴合和接近真实矽肺发生的条件,最终选择了静式染毒法作为本课题造模方法。2、从动物实验的肺系数、病理;血清HYP含量、血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量;肺组织α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表达;肺组织TGF-β1m RNA、Smad2m RNA、Smad3m RNA、Smad7m RNA表达,证实大黄?虫丸可通过调控TGF-β1/Smad通路抑制小鼠矽肺模型肺纤维化进程,且存在一定的剂量和时间依赖性。3、体外细胞实验用大黄?虫丸含药血清干预Si O₂诱导的肺泡巨噬细胞MH-S细胞系,CCK8测试细胞活力,同样观察相关炎性因子含量,以及Western-Blot和免疫荧光法检测TGF-β1、α-SMA、Smad2、Smad3、Smad7蛋白的表达,结论同动物实验一致,证明大黄?虫丸在体外细胞水平也可以通过调控TGF-β1/Smad通路抑制肺纤维化,且存在浓度依赖性。