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目的:
本研究通过利用人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)体外感染人单核白血病细胞(THP-1细胞株)后,采用发夹状RNA(shRNA)干扰、蛋白免疫印迹(Western blot)、实时荧光PCR(Real-time PCR)等实验技术,检测HCMV感染THP-1细胞后对抗病毒免疫反应和NLRP3炎症小体表达的影响;分析HCMV感染后NLRP3炎症小体的活化对THP-1细胞抗病毒免疫反应的作用;初步探讨NLRP3对抗病毒免疫反应的影响机制。本实验为HCMV感染细胞后抗病毒免疫反应的调控提供了实验依据,为HCMV感染的临床治疗提供新的思路。
方法:
1.HCMV感染THP-1细胞模型的建立
按照本课题组已构建的HCMV体外感染THP-1细胞模型的方法,设置HCMV感染组与未感染组,感染组采用HCMV Towne株感染THP-1细胞(1×106/ml,MOI=5),未感染组不加病毒,其他条件不变,于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。于感染后48h收集细胞,提取总DNA,采用Real-time PCR检测细胞内HCMV DNA拷贝数。
2.HCMV感染THP-1细胞后NLRP3炎症小体的表达水平检测
HCMV感染THP-1细胞48h后,提取细胞RNA,采用Real-time PCR检测细胞中NLRP3、Caspase-1基因水平;收集细胞沉淀,提取蛋白,采用Western blot技术检测细胞中NLRP3、Cleaved Caspase-1蛋白表达水平。
3.HCMV感染THP-1细胞后抗病毒免疫反应检测
采用shRNA技术敲低THP-1细胞cGAS的表达后,HCMV感染细胞48h,分别提取细胞DNA、RNA,采用Real-time PCR检测细胞中HCMV DNA拷贝数及IFNβ、IFIT1、IFIT2、ISG15基因水平。
4.NLRP3抑制抗病毒免疫反应的初步机制分析
采用shRNA技术敲低THP-1细胞NLRP3的表达后,HCMV感染细胞48h,分别提取细胞DNA、RNA和蛋白质,采用Real-time PCR检测细胞中HCMV DNA拷贝数及IFNβ、IFIT1、IFIT2、ISG15基因水平;采用Western blot检测p-TBK1、p-IRF3、cGAS蛋白表达水平。
结果:
1.HCMV感染THP-1细胞后NLRP3炎症小体的表达水平升高
Western blot和Real-time PCR检测结果表明,HCMV感染THP-1细胞48h后,HCMV感染组较未感染组NLRP3及Cleaved Caspase-1蛋白水平显著升高,同时NLRP3、Caspase-1的mRNA水平也明显升高,差异具有统计学意义。
2.NLRP3缺陷促进HCMV感染THP-1细胞后抗病毒因子表达
采用shRNA技术敲低THP-1细胞NLRP3的表达,HCMV分别感染敲低组与未敲低组细胞48h后,Real-time PCR检测结果表明,NLRP3敲低组细胞HCMV DNA拷贝数较未敲低组降低,IFNβ、IFIT1、IFIT2、ISG15基因mRNA水平较未敲低组均明显升高,差异具有统计学意义。
3.THP-1细胞以cGAS介导的方式产生对HCMV感染的抗病毒免疫反应
采用shRNA技术敲低THP-1细胞cGAS的表达,HCMV分别感染敲低组与未敲低组细胞48h后,Real-time PCR检测结果表明,cGAS敲低组HCMV DNA拷贝数较未敲低组升高,IFNβ、IFIT1、IFIT2、ISG15基因mRNA水平较未敲低组均明显降低,差异具有统计学意义。
4.NLRP3炎症小体抑制THP-1细胞对HCMV感染的抗病毒免疫反应机制初探
采用shRNA技术敲低THP-1细胞NLRP3的表达,HCMV分别感染敲低组与未敲低组细胞48h后,Western blot检测结果表明,NLRP3敲低组cGAS、p-TBK1、p-IRF3蛋白水平较未敲低组均显著升高,差异具有统计学意义。
结论:
1.HCMV感染THP-1细胞导致NLRP3炎症小体的活化。
2.NLRP3缺陷促进HCMV感染后THP-1细胞抗病毒因子表达。
3.THP-1细胞以cGAS介导的方式产生对HCMV感染的抗病毒免疫反应。
4.HCMV感染THP-1细胞激活NLRP3炎症小体可能通过抑制cGAS负调控抗病毒免疫反应。
本研究通过利用人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)体外感染人单核白血病细胞(THP-1细胞株)后,采用发夹状RNA(shRNA)干扰、蛋白免疫印迹(Western blot)、实时荧光PCR(Real-time PCR)等实验技术,检测HCMV感染THP-1细胞后对抗病毒免疫反应和NLRP3炎症小体表达的影响;分析HCMV感染后NLRP3炎症小体的活化对THP-1细胞抗病毒免疫反应的作用;初步探讨NLRP3对抗病毒免疫反应的影响机制。本实验为HCMV感染细胞后抗病毒免疫反应的调控提供了实验依据,为HCMV感染的临床治疗提供新的思路。
方法:
1.HCMV感染THP-1细胞模型的建立
按照本课题组已构建的HCMV体外感染THP-1细胞模型的方法,设置HCMV感染组与未感染组,感染组采用HCMV Towne株感染THP-1细胞(1×106/ml,MOI=5),未感染组不加病毒,其他条件不变,于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。于感染后48h收集细胞,提取总DNA,采用Real-time PCR检测细胞内HCMV DNA拷贝数。
2.HCMV感染THP-1细胞后NLRP3炎症小体的表达水平检测
HCMV感染THP-1细胞48h后,提取细胞RNA,采用Real-time PCR检测细胞中NLRP3、Caspase-1基因水平;收集细胞沉淀,提取蛋白,采用Western blot技术检测细胞中NLRP3、Cleaved Caspase-1蛋白表达水平。
3.HCMV感染THP-1细胞后抗病毒免疫反应检测
采用shRNA技术敲低THP-1细胞cGAS的表达后,HCMV感染细胞48h,分别提取细胞DNA、RNA,采用Real-time PCR检测细胞中HCMV DNA拷贝数及IFNβ、IFIT1、IFIT2、ISG15基因水平。
4.NLRP3抑制抗病毒免疫反应的初步机制分析
采用shRNA技术敲低THP-1细胞NLRP3的表达后,HCMV感染细胞48h,分别提取细胞DNA、RNA和蛋白质,采用Real-time PCR检测细胞中HCMV DNA拷贝数及IFNβ、IFIT1、IFIT2、ISG15基因水平;采用Western blot检测p-TBK1、p-IRF3、cGAS蛋白表达水平。
结果:
1.HCMV感染THP-1细胞后NLRP3炎症小体的表达水平升高
Western blot和Real-time PCR检测结果表明,HCMV感染THP-1细胞48h后,HCMV感染组较未感染组NLRP3及Cleaved Caspase-1蛋白水平显著升高,同时NLRP3、Caspase-1的mRNA水平也明显升高,差异具有统计学意义。
2.NLRP3缺陷促进HCMV感染THP-1细胞后抗病毒因子表达
采用shRNA技术敲低THP-1细胞NLRP3的表达,HCMV分别感染敲低组与未敲低组细胞48h后,Real-time PCR检测结果表明,NLRP3敲低组细胞HCMV DNA拷贝数较未敲低组降低,IFNβ、IFIT1、IFIT2、ISG15基因mRNA水平较未敲低组均明显升高,差异具有统计学意义。
3.THP-1细胞以cGAS介导的方式产生对HCMV感染的抗病毒免疫反应
采用shRNA技术敲低THP-1细胞cGAS的表达,HCMV分别感染敲低组与未敲低组细胞48h后,Real-time PCR检测结果表明,cGAS敲低组HCMV DNA拷贝数较未敲低组升高,IFNβ、IFIT1、IFIT2、ISG15基因mRNA水平较未敲低组均明显降低,差异具有统计学意义。
4.NLRP3炎症小体抑制THP-1细胞对HCMV感染的抗病毒免疫反应机制初探
采用shRNA技术敲低THP-1细胞NLRP3的表达,HCMV分别感染敲低组与未敲低组细胞48h后,Western blot检测结果表明,NLRP3敲低组cGAS、p-TBK1、p-IRF3蛋白水平较未敲低组均显著升高,差异具有统计学意义。
结论:
1.HCMV感染THP-1细胞导致NLRP3炎症小体的活化。
2.NLRP3缺陷促进HCMV感染后THP-1细胞抗病毒因子表达。
3.THP-1细胞以cGAS介导的方式产生对HCMV感染的抗病毒免疫反应。
4.HCMV感染THP-1细胞激活NLRP3炎症小体可能通过抑制cGAS负调控抗病毒免疫反应。