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目的:
探讨跑台训练在幼年大鼠MCAO后对缺血半暗区中神经发生和髓鞘修复的影响及其机制。
方法:
选取清洁级Sprague Dawley雄性幼年大鼠171只,23-25日龄,体重80-90g。将幼年大鼠随机分为9组:假手术组(Sham operation group,S,n=19);模型组(Model group7and14days,M7,n=19;M14,n=19);跑台训练模型组(Exercise models,EM7,n=19;EM14,n=19);抑制剂模型组(Inhibitor models,IM7,n=19;IM14,n=19);抑制剂跑台训练模型组(Inhibitor and Exercise models,IEM7,n=19;IEM14,n=19)。采用改良线栓法制作幼年大鼠脑缺血再灌注模型。MCAO后立即对IM7/IM14,IEM7/IEM14组大鼠往腹腔注射Wnt/β-Catenin信号的小分子抑制剂XAV939(40mg/kg/day)一次,然后每24小时注射一次,连续7天或14天,其余各组大鼠在同一时间往腹腔注射等量生理盐水作为空白对照。各组幼年大鼠在MCAO后的第1天、第7天和第14天进行神经行为学评分。EM7/EM14,IEM7/IEM14组的幼年大鼠MCAO后第2天开始跑台训练。各组大鼠分别观察到第7天或者第14天。采用改良神经功能缺损评分(mNSS)评定神经功能缺损程度,苏木精-伊红(HE)染色和尼氏(Nissl)染色检测脑组织损伤和神经元形态学改变,2,3,5-三苯基四氮唑(TTC)染色法测定脑梗死体积。用鲁克索坚牢蓝(LFB)染色观察髓鞘的变化。透射电镜(TEM)观察神经元超微结构。免疫荧光(IF)和免疫蛋白印迹(WB)分析其分子机制。
结果:
1.神经行为学评分结果
S组正常,无神经功能缺损症状。在MCAO后的第一天,其余八组神经功能缺损但评分无明显差异(p>0.05)。随着天数的增加各组评分逐渐降低。MCAO后7和14天:与M组相比,EM组的得分较同期M组下降(p<0.05)、IM组的得分较同期M组提高(p<0.05);与IEM组相比,EM组的得分降低但是在MCAO后7天有统计学意义(p<0.05),14天没有统计学意义(p>0.05)。
2.TTC染色结果
S组未见梗塞。MCAO后7和14天:与同期M组相比,EM组梗塞体积小于M组(p<0.01)、同期IM组梗塞体积大于M组(p<0.01);与同期EM组相比,IEM组的梗死体积更大(p<0.05)。
3.幼年大鼠脑组织结构和神经元变化
HE染色和Nissl染色:在S组中,大脑皮层中的神经元形状规则且结构正常。与S组相比,M和IM组中大量神经元肿胀、核固缩,神经细胞中尼氏小体减少甚至消失。细胞结构变形,细胞间排列紊乱,细胞肿胀,细胞间隙增大。在EM和IEM组中,细胞结构排列较M组正常,少数细胞变性坏死。
4.跑台训练上调Wnt3a、核β-Catenin、BDNF表达促进缺血半暗区中神经发生和髓鞘修复
(1)跑台训练上调Wnt3a、核β-Catenin、BDNF的表达:与S组相比,M组Wnt3a和BDNF在MCAO后7天表达增加(p<0.05)但14天没有统计学意义(p>0.05);与S组相比,M组核β-Catenin表达和BDNF的阳性细胞数在MCAO后7天和14天均增加(p<0.05)。MCAO后7、14天,与M组相比,同期EM组Wnt3a、核β-Catenin、BDNF的表达和BDNF的阳性细胞数均增加(p<0.05)。
(2)跑台训练促进神经发生和髓鞘修复:MCAO后7、14天,与S组相比,同期M组Dcx/BrdU和Nestin/BrdU的阳性细胞数增加(p<0.05);与M组相比,同期EM组Dcx/BrdU和Nestin/BrdU的阳性细胞数增加(p<0.05)。透射电镜观察神经元超微结构结果:与S组相比,同期M组染色质分布不规则,核膜结构模糊,线粒体嵴变形。与M组相比,同期EM组细胞核损伤减轻,核膜收缩不明显,细胞核边缘光滑,少数线粒体内嵴断裂。MCAO后7、14天,与S组相比,同期M组MBP的表达下降(p<0.05),NG2/BrdU的阳性细胞数增加(p<0.05)。与M组相比,同期EM组MBP的表达和NG2/BrdU的阳性细胞数增加(p<0.05),LFB染色显示,S组有髓纤维致密均匀,形态完整。MCAO后7天和14天,除S组外,其余各组均出现皮质和皮质下病变。在M组,缺血半暗区出现明显脱髓鞘。与同期M组相比,EM组脱髓鞘明显减少。
5.抑制Wnt/β-Catenin信号通路减少缺血半暗区中神经发生和髓鞘修复
(1)抑制Wnt/β-Catenin信号通路下调Wnt3a、核β-Catenin、BDNF:MCAO后7、14天,与M组相比,同期IM组Wnt3a、核β-Catenin、BDNF表达和BDNF的阳性细胞数减少(p<0.05)。
(2)抑制Wnt/β-Catenin信号通路减少神经发生和髓鞘修复:与M组相比,IM组Dcx/BrdU阳性细胞数在MCAO后7天略减少但无统计学意义(p>0.05)MCAO后14天显著减少(p<0.05);与M组相比,IM组Nestin/BrdU阳性细胞数在MCAO后7天显著减少(p<0.05)但在MCAO后14天无统计学意义(p>0.05)。神经元超微结构显示:与M组相比,同期IM组细胞质溶解、核染色质凝聚、核膜收缩或溶解。大多数细胞器消失,仅存在少数变性的线粒体(伴有局部空化)。此外,与M组相比,同期IM组MBP的表达和NG2/BrdU阳性细胞数减少(p<0.05)。LFB染色显示,与M组相比,同期IM组脱髓鞘增加。
6.抑制Wnt/β-Catenin信号通路减少跑台训练促进的神经发生和髓鞘修复
(1)抑制Wnt/β-Catenin信号通路减少跑台训练上调的Wnt3a、核β-Catenin、BDNF:MCAO后7、14天,与EM组相比,同期IEM组Wnt3a、核β-Catenin、BDNF表达和BDNF的阳性细胞数减少(p<0.05)。
(2)抑制Wnt/β-Catenin信号通路减少跑台训练促进的神经发生和髓鞘修复:与EM组相比,IEM组在MCAO后7天Dcx/BrdU和Nestin/BrdU阳性细胞数减少(p<0.05);在MCAO后14天Dcx/BrdU和Nestin/BrdU阳性细胞数虽有减少但无统计学意义(p>0.05)。在MCAO后7、14天,神经元的超微结构发现:与EM组相比,同期IEM组神经元胞浆水肿,线粒体肿胀,线粒体嵴变形,细胞器减少。与EM组相比,同期IEM组MBP的表达和NG2/BrdU阳性细胞数减少(p<0.05),但在MCAO后14天NG2/BrdU阳性细胞数是无统计学意义(p>0.05)。LFB染色显示,与EM组相比,同期IEM组脱髓鞘增加。
结论:
跑台训练通过上调Wnt/β-Catenin信号通路促进幼年大鼠脑缺血再灌注后缺血半暗区中的神经发生和髓鞘修复。
探讨跑台训练在幼年大鼠MCAO后对缺血半暗区中神经发生和髓鞘修复的影响及其机制。
方法:
选取清洁级Sprague Dawley雄性幼年大鼠171只,23-25日龄,体重80-90g。将幼年大鼠随机分为9组:假手术组(Sham operation group,S,n=19);模型组(Model group7and14days,M7,n=19;M14,n=19);跑台训练模型组(Exercise models,EM7,n=19;EM14,n=19);抑制剂模型组(Inhibitor models,IM7,n=19;IM14,n=19);抑制剂跑台训练模型组(Inhibitor and Exercise models,IEM7,n=19;IEM14,n=19)。采用改良线栓法制作幼年大鼠脑缺血再灌注模型。MCAO后立即对IM7/IM14,IEM7/IEM14组大鼠往腹腔注射Wnt/β-Catenin信号的小分子抑制剂XAV939(40mg/kg/day)一次,然后每24小时注射一次,连续7天或14天,其余各组大鼠在同一时间往腹腔注射等量生理盐水作为空白对照。各组幼年大鼠在MCAO后的第1天、第7天和第14天进行神经行为学评分。EM7/EM14,IEM7/IEM14组的幼年大鼠MCAO后第2天开始跑台训练。各组大鼠分别观察到第7天或者第14天。采用改良神经功能缺损评分(mNSS)评定神经功能缺损程度,苏木精-伊红(HE)染色和尼氏(Nissl)染色检测脑组织损伤和神经元形态学改变,2,3,5-三苯基四氮唑(TTC)染色法测定脑梗死体积。用鲁克索坚牢蓝(LFB)染色观察髓鞘的变化。透射电镜(TEM)观察神经元超微结构。免疫荧光(IF)和免疫蛋白印迹(WB)分析其分子机制。
结果:
1.神经行为学评分结果
S组正常,无神经功能缺损症状。在MCAO后的第一天,其余八组神经功能缺损但评分无明显差异(p>0.05)。随着天数的增加各组评分逐渐降低。MCAO后7和14天:与M组相比,EM组的得分较同期M组下降(p<0.05)、IM组的得分较同期M组提高(p<0.05);与IEM组相比,EM组的得分降低但是在MCAO后7天有统计学意义(p<0.05),14天没有统计学意义(p>0.05)。
2.TTC染色结果
S组未见梗塞。MCAO后7和14天:与同期M组相比,EM组梗塞体积小于M组(p<0.01)、同期IM组梗塞体积大于M组(p<0.01);与同期EM组相比,IEM组的梗死体积更大(p<0.05)。
3.幼年大鼠脑组织结构和神经元变化
HE染色和Nissl染色:在S组中,大脑皮层中的神经元形状规则且结构正常。与S组相比,M和IM组中大量神经元肿胀、核固缩,神经细胞中尼氏小体减少甚至消失。细胞结构变形,细胞间排列紊乱,细胞肿胀,细胞间隙增大。在EM和IEM组中,细胞结构排列较M组正常,少数细胞变性坏死。
4.跑台训练上调Wnt3a、核β-Catenin、BDNF表达促进缺血半暗区中神经发生和髓鞘修复
(1)跑台训练上调Wnt3a、核β-Catenin、BDNF的表达:与S组相比,M组Wnt3a和BDNF在MCAO后7天表达增加(p<0.05)但14天没有统计学意义(p>0.05);与S组相比,M组核β-Catenin表达和BDNF的阳性细胞数在MCAO后7天和14天均增加(p<0.05)。MCAO后7、14天,与M组相比,同期EM组Wnt3a、核β-Catenin、BDNF的表达和BDNF的阳性细胞数均增加(p<0.05)。
(2)跑台训练促进神经发生和髓鞘修复:MCAO后7、14天,与S组相比,同期M组Dcx/BrdU和Nestin/BrdU的阳性细胞数增加(p<0.05);与M组相比,同期EM组Dcx/BrdU和Nestin/BrdU的阳性细胞数增加(p<0.05)。透射电镜观察神经元超微结构结果:与S组相比,同期M组染色质分布不规则,核膜结构模糊,线粒体嵴变形。与M组相比,同期EM组细胞核损伤减轻,核膜收缩不明显,细胞核边缘光滑,少数线粒体内嵴断裂。MCAO后7、14天,与S组相比,同期M组MBP的表达下降(p<0.05),NG2/BrdU的阳性细胞数增加(p<0.05)。与M组相比,同期EM组MBP的表达和NG2/BrdU的阳性细胞数增加(p<0.05),LFB染色显示,S组有髓纤维致密均匀,形态完整。MCAO后7天和14天,除S组外,其余各组均出现皮质和皮质下病变。在M组,缺血半暗区出现明显脱髓鞘。与同期M组相比,EM组脱髓鞘明显减少。
5.抑制Wnt/β-Catenin信号通路减少缺血半暗区中神经发生和髓鞘修复
(1)抑制Wnt/β-Catenin信号通路下调Wnt3a、核β-Catenin、BDNF:MCAO后7、14天,与M组相比,同期IM组Wnt3a、核β-Catenin、BDNF表达和BDNF的阳性细胞数减少(p<0.05)。
(2)抑制Wnt/β-Catenin信号通路减少神经发生和髓鞘修复:与M组相比,IM组Dcx/BrdU阳性细胞数在MCAO后7天略减少但无统计学意义(p>0.05)MCAO后14天显著减少(p<0.05);与M组相比,IM组Nestin/BrdU阳性细胞数在MCAO后7天显著减少(p<0.05)但在MCAO后14天无统计学意义(p>0.05)。神经元超微结构显示:与M组相比,同期IM组细胞质溶解、核染色质凝聚、核膜收缩或溶解。大多数细胞器消失,仅存在少数变性的线粒体(伴有局部空化)。此外,与M组相比,同期IM组MBP的表达和NG2/BrdU阳性细胞数减少(p<0.05)。LFB染色显示,与M组相比,同期IM组脱髓鞘增加。
6.抑制Wnt/β-Catenin信号通路减少跑台训练促进的神经发生和髓鞘修复
(1)抑制Wnt/β-Catenin信号通路减少跑台训练上调的Wnt3a、核β-Catenin、BDNF:MCAO后7、14天,与EM组相比,同期IEM组Wnt3a、核β-Catenin、BDNF表达和BDNF的阳性细胞数减少(p<0.05)。
(2)抑制Wnt/β-Catenin信号通路减少跑台训练促进的神经发生和髓鞘修复:与EM组相比,IEM组在MCAO后7天Dcx/BrdU和Nestin/BrdU阳性细胞数减少(p<0.05);在MCAO后14天Dcx/BrdU和Nestin/BrdU阳性细胞数虽有减少但无统计学意义(p>0.05)。在MCAO后7、14天,神经元的超微结构发现:与EM组相比,同期IEM组神经元胞浆水肿,线粒体肿胀,线粒体嵴变形,细胞器减少。与EM组相比,同期IEM组MBP的表达和NG2/BrdU阳性细胞数减少(p<0.05),但在MCAO后14天NG2/BrdU阳性细胞数是无统计学意义(p>0.05)。LFB染色显示,与EM组相比,同期IEM组脱髓鞘增加。
结论:
跑台训练通过上调Wnt/β-Catenin信号通路促进幼年大鼠脑缺血再灌注后缺血半暗区中的神经发生和髓鞘修复。