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第一部分耳蜗毛细胞系OC-1及乳鼠Corti器原代培养的炎症诱导及拟老化模型的建立目的:使用脂多糖（LPS）刺激OC-1细胞及原代培养的乳鼠耳蜗Corti器,建立炎症诱导模型;使用D-半乳糖（D-gal）诱导建立拟老化模型。方法:用不同浓度的LPS刺激OC-1细胞后,使用CCK-8试剂盒检测细胞活力的变化,同时使用流式凋亡试剂盒检测不同浓度刺激之后,凋亡和死亡细胞比率的变化,筛选出合适的LPS作用浓度。我们选定1μg/m L的LPS作为刺激浓度后,再用该浓度LPS处理OC-1细胞不同的时间,使用流式凋亡试剂盒和TUNEL+DAPI染色检测凋亡细胞比率的变化,使用Mito-SOX及免疫荧光检测处理不同时间后细胞内活性氧水平的变化,筛选出LPS适宜的作用时间。随后,我们收集LPS刺激后的细胞上清和细胞,使用ELISA法检测多种炎症因子的变化,进一步验证该模型的建立。在拟老化模型的建立中,我们使用D-半乳糖（D-gal）刺激细胞,检测细胞mt DNA常见缺失的变化,同时使用电镜观察细胞结构的变化。之后,我们使用流式凋亡试剂盒检测凋亡细胞比率的变化,Mito-SOX染色检测细胞内活性氧水平的变化,用以验证拟老化模型的建立。体外原代培养实验中,我们取3日龄（P）GFP-LC3B乳鼠,酒精消毒断头后,取颞骨放在预冷好的无菌HBSS液中,在解剖显微镜下精细操作,取出耳蜗基底膜组织,放置在预先配置好的Rat Col胶上,加入组织培养基,放入37℃,5%CO2的培养箱中恢复过夜。第二天加入LPS和D-gal处理基底膜组织,处理不同时间后固定组织,使用Myosin7a+DAPI染色,进行耳蜗毛细胞计数,筛选适宜的作用浓度和时间。结果:使用不同浓度LPS刺激OC-1细胞48小时后,CCK-8检测结果显示LPS浓度为1μg/m L时,细胞密度较空白对照组无明显变化;当浓度高于5μg/m L时,细胞密度减少（P<0.05）,即提示细胞活性开始受到影响。使用PI标记死亡细胞,Annexin V标记凋亡细胞进行流式分析检测,结果显示LPS浓度为1μg/m L时,早期凋亡细胞比率较空白对照组升高（P<0.01）,死亡细胞比率也升高（P<0.01）。随着LPS浓度逐渐增加,凋亡细胞和死亡细胞比率逐渐升高,但细胞状态明显变差,因此选用1μg/m L LPS处理OC-1细胞。使用1μg/m L LPS分别处理OC-1细胞24h、48h、72h及96h,凋亡细胞随着干预时间逐渐增加,细胞内活性氧水平也逐渐增加,24h组与空白对照组相比凋亡细胞及活性氧水平都无统计学差异,48h组较空白对照组相比凋亡细胞增加（p<0.05）,细胞内活性氧水平明显增加（p<0.01）。使用ELISA检测1μg/m L LPS处理48小时后细胞上清中炎症因子的变化,IL-6相比对照组升高（p<0.05）。因此后续选用1μg/m L LPS处理OC-1细胞48小时作为炎症刺激条件。根据本实验室前期数据,采用15mg/ml D-gal刺激OC-1细胞72h诱导OC-1细胞拟老化,PCR检测mt DNA常见缺失比率较对照组明显增加（p<0.001）。流式检测D-gal处理后凋亡细胞和死亡细胞比率明显增高（p<0.001）,细胞活性氧水平也明显升高（p<0.001）。电镜结果发现,D-gal处理后细胞核仁比降低,细胞核膜皱缩,线粒体肿胀。随后,在体外培养耳蜗基底膜组织中分别加入LPS和D-gal处理。在0.5μg/m L LPS刺激48h后,可发现毛细胞计数开始出现丢失（p<0.05）,耳蜗基底膜培养形态尚可。在10mg/ml D-gal刺激72小时后,毛细胞计数明显丢失（p<0.01）,毛细胞排列开始出现紊乱。在共同作用组中,先使用D-gal处理24h,再使用LPS+D-gal共同处理48h,此时毛细胞丢失明显（p<0.001）,基底膜细胞受损严重,细胞排列紊乱。结论:成功建立OC-1细胞的炎症及拟老化模型,使用1μg/m L LPS作用48小时诱导细胞炎症应激,使用15mg/ml D-gal刺激72h诱导细胞拟老化。成功建立乳鼠耳蜗基底膜体外原代培养的炎症刺激及拟老化模型。第二部分 FoxG1和自噬水平在拟老化毛细胞炎症反应中的变化目的:研究炎症刺激对毛细胞拟老化敏感性的影响。探究炎症刺激及拟老化后, FoxG1表达量的变化及自噬通路的激活情况,分析可能的分子调控机制。方法:使用D-gal处理细胞24h后,用LPS+D-gal共处理48h建立炎症诱导的拟老化组,通过Annexin V/PI和TUNEL荧光染色检测凋亡和死亡细胞比率的变化;使用Mito-SOX及荧光染色检测不同处理情况下,线粒体内活性氧水平的变化。使用q PCR检测LPS+D-gal组CD的变化;炎症刺激及拟老化状态处理后,相关凋亡基因的变化。通过Western Blot和免疫荧光检测LPS刺激不同时间后,细胞内 FoxG1表达量的变化。通过Western Blot和转染m RFP-GFP-LC3荧光质粒检测LPS刺激不同时间后,细胞内自噬流水平的变化。结果:流式凋亡检测和TUNEL染色结果显示,与D-gal处理组相比,D-gal+LPS处理组的凋亡细胞明显增加（p<0.01）,死亡细胞也增加（p<0.05）。活性氧检测结果显示,D-gal+LPS处理组线粒体活性氧水平较D-gal组升高（p<0.01）。PCR结果显示,D-gal+LPS组的CD较D-gal组升高,但无统计学差异。q PCR结果显示较空白对照组相比,LPS、D-gal、LPS+D-gal组凋亡相关基因逐渐升高,抗凋亡相关基因逐渐降低,Bcl2/Bax比率逐渐降低。Western Blot结果显示,随着LPS作用时间增加, FoxG1表达量先增加,48小时表达量最高（p<0.05）,随后明显降低（p<0.01）,免疫荧光结果与Western Blot趋势一致。使用Western Blot检测自噬标记物LC3B-II来监测细胞内自噬流的变化,随着LPS作用时间增加,LC3B-II表达量先增加,48h表达量最高（p<0.01）,之后表达降低;免疫荧光结果显示,自噬小体和自噬溶酶体在48h数量最多（p<0.001）,随后开始降低。结论:LPS+D-gal处理后,细胞损伤加重,线粒体活性氧增加,线粒体功能受到损伤,同时诱导激活凋亡相关基因。 FoxG1在炎症刺激时,表达量先增加后降低,细胞内自噬水平的变化也与 FoxG1表达量的变化趋势相同,提示 FoxG1可能是自噬通路的调控因子。 FoxG1表达降低后,炎症诱导的细胞凋亡比率和线粒体活性氧水平都明显增加,提示 FoxG1可能是细胞保护性因子。第三部分 FoxG1与自噬信号在拟老化OC-1细胞炎症反应中的协同调控作用目的:探讨盒转录因子 FoxG1是否能调控自噬通路, FoxG1的表达变化在炎症刺激和拟老化过程中是否对OC-1细胞的存活造成了影响并研究其可能的机制。方法:通过siRNA- FoxG1转染下调 FoxG1的表达,给予自噬激活剂雷帕霉素（Rap）刺激细胞,将实验组分为四组:空白对照组、Rap组、siRNA- FoxG1组、siRNA- FoxG1+Rap组,通过Western Blot检测LC3B-II和自噬底物P62蛋白表达的变化。在转染siRNA抑制 FoxG1的表达后,使用LPS刺激细胞,检测LC3B-II蛋白的表达变化,使用透射电镜观察细胞内自噬囊泡和自噬溶酶体数量的变化。分别通过转染siRNA抑制 FoxG1的表达和Rap激活自噬后,使用Annexin V/PI和Mito-SOX检测LPS刺激后细胞凋亡比率和线粒体活性氧水平的变化。用P3的GFP-LC3B乳鼠基底膜作原代培养,分别使用不同浓度LPS、D-gal、LPS+D-gal刺激组织,使用Western Blot检测 FoxG1和LC3B-II蛋白的表达变化;免疫荧光观察不同处理后,自噬荧光点数量的变化。通过Western Blot检测对照组、LPS、D-gal、D-gal+LPS组的 FoxG1和LC3B-II蛋白表达变化;通过转染m RFP-GFP-LC3荧光质粒和透射电镜检测细胞自噬流的变化。分别通过转染siRNA抑制 FoxG1的表达和Rap激活自噬后,使用Annexin V/PI和Mito-SOX检测D-gal、LPS+D-gal组细胞凋亡比率和线粒体活性氧水平的变化。分别提取D-gal处理后胞浆和胞核蛋白,通过Western Blot检测 FoxG1的表达变化。结果:Western Blot结果显示,Rap激活自噬后,P62蛋白表达降低,LC3B-II表达升高;siRNA- FoxG1+Rap组P62和LC3B-II蛋白与空白对照组无明显差异。Western Blot结果显示siRNA- FoxG1+LPS较LPS组 FoxG1和LC3B-II蛋白表达明显降低（p<0.01）;电镜观察细胞内自噬囊泡和自噬溶酶体数量明显减少（p<0.01）。流式结果显示,使用Rap激活自噬后,LPS诱导的凋亡细胞比率降低（p<0.05）;使用siRNA- FoxG1转染后,LPS诱导的凋亡和死亡细胞比率明显增加（p<0.001）,且Rap的保护效果明显减弱（p<0.01）。线粒体活性氧结果显示,LPS组和LPS+Rap组线粒体活性氧水平无明显差异;但使用siRNA- FoxG1转染后,LPS诱导线粒体活性氧明显增加（p<0.01）。体外培养的Western Blot结果显示,随着LPS作用浓度增加, FoxG1和LC3B-II的表达逐渐增加,在0.5μg/m L时,两者的表达量增加有统计学差异（p<0.05）,随后两者表达量都开始降低。使用不同D-gal诱导体外培养基底膜拟老化后,Western Blot结果显示随着D-gal浓度的增加, FoxG1和LC3B-II的表达逐渐降低,在10mg/ml时有统计学差异（p<0.05）。在LPS+D-gal组中, FoxG1和LC3B-II的表达较LPS或D-gal单独处理时都降低。免疫荧光结果显示,0.5μg/mg LPS刺激时,GFP-LC3荧光点较对照组明显增加（p<0.01）;10mg/ml D-gal刺激时,GFP-LC3荧光点较对照组明显减少（p<0.01）;LPS+D-gal刺激时,GFP-LC3荧光点较D-gal刺激进一步减少（p<0.01）。Western Blot显示D-gal处理后, FoxG1表达量较对照组降低（p<0.01）;LPS+D-gal组 FoxG1表达量较D-gal组进一步降低（p<0.01）,LC3B-II较LPS组降低（p<0.05）。免疫荧光显示,LPS+D-gal组自噬小体和自噬溶酶体均比LPS组减少（p<0.001）。电镜结果也显示,LPS+D-gal组自噬小体和自噬溶酶体均比LPS组减少（p<0.01）。流式结果显示,siRNA- FoxG1+D-gal组凋亡和死亡细胞比率较D-gal组明显增加（p<0.001）;siRNA- FoxG1+D-gal+LPS组凋亡细胞比率较D-gal+LPS组明显增加（p<0.001）;D-gal+LPS+Rap组凋亡细胞较D-gal+LPS组减少（p<0.001）。线粒体活性氧检测显示,siRNA- FoxG1+D-gal组ROS水平较D-gal组明显增加（p<0.01）,D-gal+Rap组ROS比D-gal组明显降低（p<0.01）;D-gal+LPS组ROS较D-gal组明显升高（p<0.001）,D-gal+LPS+Rap组ROS较D-gal+LPS组降低（p<0.05）;siRNA- FoxG1+D-gal+LPS组ROS较D-gal+LPS组明显增加（p<0.01）。 FoxG1在D-gal处理后,胞核内表达减少（p<0.01）,胞浆内表达量无明显变化。结论: FoxG1能通过调节自噬水平影响细胞对炎症和拟老化的敏感性。当 FoxG1表达下降时,自噬通路的激活受到抑制,拟老化毛细胞对炎症的敏感性增加。 FoxG1在炎症和拟老化过程中可以通过调控自噬通路影响线粒体活性氧的生成来影响细胞的凋亡和死亡。