【摘 要】
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背景缺血性卒中是目前全球发病率、致残率、致死率居高不下的疾病之一,溶栓和取栓（即及早再灌注）是当前脑梗死最有效的治疗方法。然而脑组织持续缺血缺氧一定时间后恢复再灌注反而出现再灌注损伤,导致患者疗效降低,而目前尚无有效的治疗手段。近年临床研究发现激活胰高血糖素样肽-1受体（Glucagon-Like Peptide-1 Receptor,GLP-1R）具有减轻脑缺血再灌注损伤作用。GLP-1是由原胰
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背景缺血性卒中是目前全球发病率、致残率、致死率居高不下的疾病之一,溶栓和取栓（即及早再灌注）是当前脑梗死最有效的治疗方法。然而脑组织持续缺血缺氧一定时间后恢复再灌注反而出现再灌注损伤,导致患者疗效降低,而目前尚无有效的治疗手段。近年临床研究发现激活胰高血糖素样肽-1受体（Glucagon-Like Peptide-1 Receptor,GLP-1R）具有减轻脑缺血再灌注损伤作用。GLP-1是由原胰高血糖素基因表达,在小肠L细胞分泌的肠道激素,在体内发挥多种多效性作用。小胶质细胞为中枢系统的固有免疫细胞,其活化标志着炎症得发生,有研究证实小胶质细胞焦亡介导的炎症反应可加剧脑缺血再灌注损伤,抑制小胶质细胞焦亡有望为脑缺血再灌注损伤提供新的思路。目的此研究拟采用体外培养BV2小胶质细胞,建立OGD/R的细胞模型模拟体内脑缺血再灌注损伤,在此基础上,明确激活GLP-1R是否通过抑制细胞焦亡对损伤模型具有保护作用,为防治脑缺血再灌注损伤提供新思路及治疗新靶点。同时为下一步在体内、体外层面研究GLP-1R的神经保护作用及相关分子作用机制提供可靠的实验基础。方法通过采用正常小胶质细胞（BV2细胞）,利用三气培养箱和无糖培养基模拟ODG/R条件,根据参考文献选取氧糖剥夺时间为4h、6h、8h和10h,复氧复糖时间为0h、6h、12h、18h和24h;细胞经过OGD/R处理后,通过CCK8检测细胞存活率,选取存活率约50%的时间组合建立OGD/R模型。综合参考文献选取剂量为0n M、25n M、50n M、100n M、200n M、400n M的GLP-1受体激动剂艾塞那肽-4（Exendin-4,EX-4）对实验细胞进行预处理24小时,进行ODG/R处理,通过CCK8检测细胞存活率选取最佳剂量。确定建立OGD/R模型时间组合及最佳EX-4浓度后,将BV2进行实验分组:（1）空白对照组为正常的BV2细胞;（2）OGD/R组:仅进行OGD/R处理的BV2细胞;（3）EX-4+OGD/R组:BV2经过GLP-1R激动剂预处理后进行OGD/R处理;（4）BV2经过GLP-1R拮抗剂预处理后进行OGD/R。收集细胞提取总蛋白及细胞培养基上清液,采用Western Blot检测NLRP3、caspase-1蛋白的表达水平;通过ELISA检测IL-1β、IL-18的分泌情况;制备细胞爬片,通过免疫荧光分析NLRP3表达水平。结果1.氧糖剥夺时间为6h及复氧复糖时间为12h的OGD/R时间组合,细胞的存活率最接近50%且恢复氧糖供应后细胞存活率下降明显,能有效反应脑缺血再灌注损伤的时间组合模型。2.OGD/R组NLRP3、caspase-1蛋白表达水平及IL-1β、IL-18分泌水平明显高于空白对照组（NLRP3、caspase-1蛋白表达水平及IL-1β分泌水平与空白对照组比较P<0.001,IL-18分泌水平的为P<0.01）,说明细胞焦亡介导的炎症反应可能加剧脑缺血再灌注损伤。3.EX-4预处理+OGD/R组BV2细胞NLRP3、caspase-1蛋白表达水平及IL-1β、IL-18的分泌水平较OGD/R组下降（NLRP3蛋白表达的水平及IL-1β分泌水平与OGD/R组比较P<0.001,caspase-1蛋白表达水平及IL-18分泌水平的为P0.05）,说明激活GLP-1R可抑制小胶质细胞NLRP3炎性小体表达。结论1.BV2细胞建立缺血再灌注模型,在氧糖剥夺6h及复氧复糖12h时最接近人体内脑缺血再灌注后细胞状态。2.EX-4可通过抑制BV2细胞NLRP3炎性小体介导的炎症反应发挥保护作用。
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