论文部分内容阅读
肝细胞癌（HCC）发病率占恶性肿瘤的第六位,是全球第四位肿瘤致死病因,流行病学调查结果显示,我国每年约有46.6万新发病例和42.2万死亡人数,约占全球HCC总发病率和死亡率的50%,患者五年生存率仅有10.1%。病毒感染是HCC发病的主要风险因素之一,我国70～90%的HCC与乙型肝炎病毒感染相关。HCC发生和进展的分子机制尚不明确。醛糖还原酶（AKR1B1）在多种恶性肿瘤中表达异常,如结肠癌、乳腺癌和肾上腺皮质瘤等,是潜在的肿瘤标志物。多项研究提示,AKR1B1在HCC发生及发展过程中过度表达或激活,但相关研究一直存在分歧:Cao等首次通过Northern Blot检测到29%的肝细胞癌组织中AKR1B1 m RNA水平高于癌旁组织;Scuric等研究也显示,肝细胞癌患者的肿瘤组织中AKR1B1 m RNA水平显著增加;Zeindl-Eberhart等通过蛋白质二维电泳分析表明,肝细胞癌组织中AKR1B1表达上调;但Goh对肝细胞癌蛋白质表达谱的分析显示,AKR1B1表达水平在癌与癌旁无明显差异。因此,需进一步确证AKR1B1在人肝细胞癌组织中的表达及临床意义;AKR1B1在人肝细胞癌组织和细胞中异常表达的诱因、机制、功能需进一步深入研究。本课题的主要研究内容如下:1.肝细胞癌中AKR1B1的表达及临床意义目的:探究AKR1B1在人肝细胞癌（HCC）组织及对应癌旁组织中的表达,并分析其在HCC组织中表达的临床意义。分析不同肝癌细胞系和正常胎肝细胞L-02中AKR1B1的表达差异。方法:通过免疫组化检测肝癌组织以及对应癌旁组织中AKR1B1的表达水平,采用Bresalier半定量公式判断染色结果,统计分析其与HCC患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分化程度、AFP表达水平、是否肝硬化等临床特征的相关性;通过免疫组化检测肝癌组织中HBV的感染,分析AKR1B1表达水平与HBV感染之间的相关性。选择正常胎肝细胞L-02及不同肝癌细胞系Huh7,Hep G2,Hep G2.2.15,Bel-7402,Bel-7404,Bel-7405,SMMC-7721,MHCC-97H,MHCC-97L等,通过Western Blot比较分析各细胞系中AKR1B1的表达水平。结果:免疫组化结果显示,70例HCC患者肿瘤组织样本中有38例AKR1B1表达呈阳性（54.29%）。AKR1B1高表达与HCC患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分化程度、血清AFP表达水平、是否肝硬化等临床特征之间无显著相关性,差异无统计学意义（P>0.05）。通过免疫组化检测其中50例HCC患者乙肝表面抗原（HBs Ag）表达水平,并分析AKR1B1表达水平与HBV感染的相关性,结果显示,HBV感染阳性HCC患者的肿瘤组织中AKR1B1表达阳性率（75.75%）显著高于HBV感染阴性的HCC患者（47.06%）（P=0.009）;肿瘤组织中AKR1B1表达水平与患者HBV感染程度呈显著正相关（r=0.4663,P=0.0024）。Western Blot结果显示,所检测的9种肝癌细胞系中均存在不同程度的AKR1B1表达,转移潜能较高的细胞系MHCC-97H和MHCC-97L中AKR1B1表达水平显著高于其他细胞;且来源于HBV感染阳性患者的细胞系（MHCC-97L,MHCC-97H和Bel-7405）中AKR1B1表达水平较高,而来源于HBV感染阴性患者的细胞系（Hep G2和Huh7）中低表达,持续表达HBV基因组的Hep G2.2.15细胞中AKR1B1表达水平显著高于Hep G2细胞。2.AKR1B1对肝癌细胞生物学行为的影响目的:探究AKR1B1对肝癌细胞生物学行为（体外增殖、迁移、侵袭）的影响。方法:通过si RNA敲低Bel-7402细胞AKR1B1表达,采用CCK-8法检测细胞增殖能力变化,通过Transwell及划痕实验检测细胞迁移能力变化,通过Transwell实验检测细胞侵袭能力变化。结果:敲低Bel-7402细胞中AKR1B1表达,并未降低细胞的体外增殖能力,但能够引起细胞体外迁移及侵袭能力显著降低。3.氧化应激反应参与调控肝癌细胞AKR1B1表达的分子机制目的:探究H2O2诱导的氧化应激反应参与调控肝癌细胞AKR1B1表达的分子机制。方法:使用100μM H2O2诱导肝癌细胞系发生氧化应激反应,通过Western Blot及RT-q PCR检测肝癌细胞中AKR1B1表达改变;构建含有AKR1B1基因启动子区的荧光素酶报告基因质粒,转染至Huh7细胞中,100μM H2O2处理细胞,通过双荧光素酶报告基因实验检测H2O2对AKR1B1基因启动子区活性影响;构建系列截短的荧光素酶报告基因质粒,通过检测荧光素酶活性确定参与调控的关键启动子区片段;通过生物信息学分析,预测其中的顺式作用元件及参与调控的转录因子,构建突变质粒进行双荧光素酶报告基因实验,寻找H2O2诱导的氧化应激反应参与调控肝癌细胞中AKR1B1基因表达的关键转录因子。结果:100μM H2O2诱导的氧化应激反应能够引起肝癌细胞中AKR1B1 m RNA及蛋白质水平上调;H2O2处理能够显著增强AKR1B1基因启动子区活性。H2O2诱导的氧化应激反应参与调控AKR1B1基因表达的关键顺式作用元件位于其启动子区-1188～-688 bp之间;生物信息学分析其中的顺式作用元件有378个,其中包含已知的与氧化应激调控相关的转录因子AP-1及Nrf2结合位点,对这两种转录因子的结合位点进行缺失突变,并未影响氧化应激反应对AKR1B1基因启动子区活性调控。