精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）是位于睾丸曲细精管内部基底膜上的一类干细胞,它能通过自我更新来维持自身群体数量的稳定,同时又能够通过减数分裂分化产生精子,是雄性成年哺乳动物体内唯一能通过自然生殖过程将遗传信息传递给下一代的成体干细胞。奶山羊精原干细胞（dairy goats spermatogonial stem cells,GSSCs）是从青春期或者性成熟的雄性山羊睾丸中分离出来的一种成体干细胞。奶山羊作为关中地区的重要家畜,研究其精原干细胞对优质山羊育种和开展转基因羊研究具有深远的意义,另外对于珍惜动物保护和治疗人类的不育症能够提供一定的理论基础。Eif2s3y作为翻译起始因子家族e IF2γ的编码基因,其形成的e IF-2聚合体可以行使翻译起始的功能。近年来的一些研究表明,Eif2s3y在小鼠精子形成过程中起到了不可缺少的重要作用,在体外诱导产生精细胞的过程中过表达该基因可以提高诱导效率。然而其内在的调控机制并不清楚,亦不清楚Eif2s3y对精原干细胞的增殖和分化能够产生什么影响。同时该基因在家畜的生殖发育中起到什么作用?并没有相关的报道。本文的研究目的就是探索Eif2s3y对奶山羊精原干细胞中的调控机理,并找到其主要信号通路。本研究从奶山羊的睾丸克隆得到Eif2s3y基因的CDS序列（KP326346）,发现该基因在奶山羊的各个组织器官都有着广泛的表达,并且不同物种间具有高度保守性。接着构建了重组质粒,通过过表达和敲低GSSCs中Eif2s3y的表达水平,发现Eif2s3y能够促进GSSCs的增殖,同时可以降低GSSCs的凋亡。在白消安处理的生精缺陷小鼠模型中,Eif2s3y能够促进曲细精管的修复和各级生精细胞的再生。而将小鼠睾丸的Eif2s3y敲低之后,小鼠的各级生精细胞数量锐减。进一步的信号通路激活剂和抑制剂实验发现,Eif2s3y可能通过ERK1/2通路来调控奶山羊精原干细胞的增殖,并且通过抑制内质网应激来减少精原细胞的凋亡。该研究揭示了Eif2s3y在奶山羊精子发生过程中扮演着重要的角色并阐释了作用机制,取得了以下成果:1.Eif2s3y促进GSSCs的增殖首先,通过设计奶山羊Eif2s3y基因的克隆引物,在奶山羊睾丸的m RNA中克隆出了Eif2s3y的CDS序列,之后利用该序列设计了高特异性的q RT-PCR引物,用该引物对不同年龄段的奶山羊睾丸m RNA中的Eif2s3y的表达水平进行检测,发现Eif2s3y随着山羊年龄的增加表达量不断升高,直至性成熟后达到峰值。接着,通过对山羊不同组织器官m RNA的检测,发现睾丸中高度表达Eif2s3y。然后,分离出奶山羊的精原干细胞,并在GSSCs中过表达Eif2s3y,构建出过表达细胞株,通过对过表达细胞株的q RT-PCR检测、绘制生长曲线、Edu染色以及流式细胞术等技术,发现过表达Eif2s3y促进了细胞的增殖速度,使群体倍增时间缩短,Edu阳性百分比明显高于对照组,且S期细胞比率也比对照组高。这些实验结果证实了Eif2s3y可以促进GSSCs中增殖相关基因CCND1、PCNA、Cyclin A等表达,促进了GSSCs的增殖。2.Eif2s3y激活MEK-Erk1/2通路调控GSSCs的增殖前面的研究发现,Erk1/2通路在过表达Eif2s3y以后被激活了,因此进一步构建了干扰细胞株结合MEK-Erk1/2通路的抑制剂和激活剂来进一步研究该通路的调控作用。发现干扰Eif2s3y的细胞系增殖速度明显下降,且磷酸化的Erk1/2蛋白减少,加入MEKErk1/2通路的激活剂后,增殖速度得到恢复。对过表达Eif2s3y的细胞添加抑制剂后,增殖速度减慢,且磷酸化的Erk1/2蛋白减少。通过以上实验,证实了Eif2s3y确实是通过ERK1/2通路影响GSSCs的增殖。3.Eif2s3y能够提高GSSCs的抗凋亡能力首先检测了过表达Eif2s3y的细胞株的m RNA水平,发现Caspase3明显下降。接着进行Anncxin V-FITC/PI染色,荧光显微镜下观察凋亡比率,发现Eif2s3y过表达组比对照组凋亡比率下降,流式细胞术检测也得到了相同的结果。Western blotting的检测结果发现Caspase3、Caspase12和CHOP都显著下调,所以该研究认为Eif2s3y可能通过抑制内质网应激来降低细胞的凋亡率,促进细胞的存活。