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研究目的与意义:帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是以黑质（substantia nigra,SN）中多巴胺能神经元丢失为病理特征的中枢神经系统退行性疾病,临床现有治疗方法无法治愈。危险警报分子HMGB1等的释放、小胶质细胞的活化、单核/巨噬细胞、CD4+T细胞的浸润等在帕金森患者神经损伤过程中发挥重要作用,但具体机制仍不清楚。本课题以小鼠PD模型为研究对象,详细探究HMGB1 A Box蛋白影响外周免疫细胞浸润、分化、神经胶质细胞活化,保护神经元的机制,为靶向HMGB1治疗帕金森病提供理论基础。研究方法:1.HMGB1 A Box对帕金森病模型小鼠的保护作用（1）在MPTP小鼠帕金森病模型中应用HMGB1 A Box、丙酮酸乙酯（Ethyl pyruvate,EP）后,IHC评估SN与纹状体多巴胺能神经元数量;免疫荧光评估SN中小胶质细胞活化以及T细胞、巨噬细胞、树突状细胞（Dendritic Cells,DCs）浸润情况;Western Blot检测中脑TH水平。同时FCM检测中脑、脾脏CD4+T细胞、CD4+IL-17A+Th17以评估CD4+T细胞的浸润和Th17分化。（2）MPP+诱导的新生鼠中脑细胞模型（PD的细胞模型,中脑神经元被MPP+特异性损伤）中,HMGB1 A Box、EP处理后,Iba1免疫荧光评估小胶质细胞活化情况;或二硫键形式HMGB1（Disulfide HMGB1,ds HMGB1）刺激中脑细胞后,加入上述处理,Iba1免疫荧光评估小胶质细胞活化情况。（3）在MPTP小鼠帕金森病模型体内应用HMGB1 A Box、EP后,进行黑质CD45、CD3、CD4、CD8、F4/80、CD11c、CD31免疫荧光,检测SN中T细胞、巨噬细胞、DCs浸润情况,FCM检测SN中CD45、CD4和IL-17A,评估Th17水平。2.小胶质细胞、单核/巨噬细胞对SN中浸润的Th17分化的影响（1）新生鼠中脑细胞与脾脏na（?）ve CD4+T细胞共培养,以MPP+诱导体外多巴胺能神经元损伤,加入HMGB1 A Box、EP处理,FCM检测CD4+IL-17A+Th17比例以评估体外PD模型中HMGB1 A Box对Th17分化的影响。（2）新生鼠中脑小胶质细胞与脾脏na（?）ve CD4+T细胞共培养,ds HMGB1刺激,加入HMGB1 A Box、EP处理,FCM检测CD4+IL-17A+Th17比例以评估HMGB1 A Box经由小胶质细胞对Th17分化的影响。（3）新生鼠中脑细胞（去除/不去除小胶质细胞）以ds HMGB1刺激,使用/不使用HMGB1 A Box干预,然后分别与分选自脾脏na（?）ve CD4+T细胞共培养,FCM检测CD4+IL-17A+Th17比例以评估体外模型中HMGB1 A Box对HMGB1诱导的Th17分化的影响。（4）MPTP诱导小鼠帕金森病模型,尾静脉注射HMGB1 A Box、氯膦酸二钠脂质体（Clodronate liposomes）,FCM检测中脑小胶质、巨噬细胞和Th17数量,以评估敲除外周单核/巨噬细胞后对T细胞在SN中的浸润和分化的影响;去除来自正常对照组、MPTP模型组、A Box处理组中脑细胞中的小胶质细胞,与原代na（?）ve CD4+T细胞共培养,FCM检测Th17比例,以评估单核/巨噬细胞对Th17分化的作用以及A Box的抑制作用。3.HMGB1 A Box抑制小胶质细胞活化的机制（1）MPTP诱导小鼠帕金森病模型,应用HMGB1 A Box、EP,Western Blot检测中脑CD200、CD200R水平;（2）MPP+诱导中脑细胞体外PD模型,HMGB1A Box、EP处理,FCM检测小胶质细胞CD200、CD200R表达;（3）生鼠中脑小胶质细胞,ds HMGB1刺激,加入HMGB1 A Box、EP处理,免疫荧光检测CD200、CD200R;（4）新生鼠中脑小胶质细胞,过表达CD200R,再经ds HMGB1刺激,ELISA检测TNF-α、IL-1β、IL-6;过表达CD200R、对照小胶质细胞分别与中脑神经元共培养,加入MPP+诱导神经元损伤,Western Blot检测TH水平以评估过表达CD200R对神经元的有保护作用。4.HMGB1 A Box抑制外周/单核巨噬细胞和T细胞向SN浸润的机制（1）MPP+诱导中脑细胞PD模型,与原代巨噬细胞构成Transwell共培养体系,分别加HMGB1 A Box、抗HMGB1中和抗体、抗CXCR4中和抗体以及AMD3100（CXCL12-CXCR4结合的拮抗剂）评估HMGB1、CXCR4、HMGB1和CXCL12-CXCR4在其中的作用;（2）免疫共沉淀检测MPP+诱导PD中脑细胞上清中HMGB1/CXCL12的结合;MPP+诱导PD中脑细胞的培养上清处理原代巨噬细胞,免疫共沉淀检测CXCR4与CXCL12、HMGB1的结合;在HMGB1 A Box处理巨噬细胞后免疫共沉淀和免疫荧光检测HMGB1 A Box与CXCR4的结合;（3）分离原代中脑神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞,分别慢病毒转染干扰HMGB1,以不同组合共培养,并与原代巨噬细胞组成Transwell共培养体系,确定引起巨噬细胞迁移的HMGB1来源细胞;（4）分选GFP鼠来源CD3+T细胞并分别以CXCR4中和抗体、HMGB1 A Box体外处理后回输WT小鼠,对该小鼠注射MPTP制造PD模型,免疫荧光检测SN中CD3+GFP+T细胞数量,以评估CXCR4在T细胞迁移中的作用,以及确定HMGB1 A Box是否对T细胞迁移浸润有直接的抑制作用;在HMGB1 A Box处理CD3+T细胞后检测HMGB1 A Box与CXCR4的结合;5.PD病人样本的相关数据检测PD病人血清中HMGB1和CXCL12,以及免疫共沉淀检测其是否结合,并对这两种因子进行相关性分析。研究结果:1.HMGB1 A Box抑制了免疫细胞的浸润/分化与小胶质细胞的活化、保护了PD小鼠神经元损伤。体内小鼠脑免疫组化和Western Blot结果表明,HMGB1A Box注射保存了MPTP鼠SN和纹状体中TH+神经元或神经纤维的数量;免疫荧光和FCM数据表明,HMGB1 A Box注射抑制了巨噬细胞在SN中的浸润、Th17细胞浸润/分化,亦减少了MPP+或ds HMGB1诱导的Iba1+小胶质细胞活化。2.HMGB1 A Box抑制了活化的小胶质细胞以及浸润的单核/巨噬细胞诱导的Th17分化。体外小鼠中脑细胞、小胶质细胞、单核/巨噬细胞分别与na（?）ve CD4+T细胞共培养实验表明,HMGB1 A Box抑制了由于上述细胞的活化/浸润诱导的Th17分化;体内小鼠外周单核/巨噬细胞耗竭实验进一步支持MPTP模型中,浸润单核/巨噬细胞促进了Th17的分化;而分离MPTP模型小鼠中脑细胞培养的体外实验进一步证实,小胶质细胞与单核/巨噬细胞均促进了Th17的分化。3.HMGB1 A Box通过调控CD200-CD200R轴抑制了小胶质细胞的活化。体内小鼠中脑Western Blot结果表明,HMGB1 A Box注射恢复了中脑中整体免疫抑制性信号CD200-CD200R的水平;体外中脑细胞模型FCM检测结果和体外原代小胶质细胞免疫荧光结果显示,HMGB1 A Box处理恢复了小胶质细胞CD200、CD200R的水平;体外原代小胶质细胞过表达CD200R后与原代中脑神经元共培养实验表明,上调了CD200R水平的小胶质细胞在MPP+诱导的体外细胞模型中能减少TH+神经元损伤。4.HMGB1 A Box通过调控HMGB1/CXCL12-CXCR4轴抑制了单核/巨噬细胞和T细胞向SN的浸润。体外Transwell实验表明,巨噬细胞向中脑的迁移依赖HMGB1/CXCL12-CXCR4轴;免疫共沉淀实验和免疫荧光共聚焦结果显示,HMGB1 A Box可以与巨噬细胞表面的CXCR4结合,MPP+诱导的模型上清中有HMGB1/CXCL12复合物存在;慢病毒敲减HMGB1后的中脑神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞分别与巨噬细胞Transwell实验确定了诱导单核/巨噬细胞迁移浸润的HMGB1主要来源于损伤的神经元细胞;GFP+CD3+T细胞回输实验证实了HMGB1 A Box对T细胞迁移浸润有直接的抑制作用,免疫共沉淀实验和免疫荧光共聚焦结果显示,HMGB1 A Box同样可以直接结合CD3+T细胞表面的CXCR4发挥抑制作用。5.HMGB1/CXCL12复合物在PD患者中存在。PD患者血清中HMGB1、CXCL12水平均高于健康人;PD患者血清中HMGB1水平与CXCL12水平呈显著正相关,免疫共沉淀实验也证实,血清中HMGB1与CXCL12结合;患者CXCL12水平与年龄呈显著负相关。研究结论:1、小鼠MPTP帕金森病模型中HMGB1 A Box保护了神经元损伤,抑制了单核/巨噬细胞向SN中浸润与Th17细胞的浸润/分化和小胶质细胞的活化,这一过程主要与以下三个机制有关:（1）HMGB1 A Box通过结合CXCR4,竞争性抑制了神经元来源的fr HMGB1（完全还原形式HMGB1）诱导的T细胞和外周单核/巨噬细胞在SN中的浸润;（2）活化的小胶质细胞以及浸润的单核/巨噬细胞均可以诱导Th17细胞的分化;（3）HMGB1 A Box通过恢复SN中小胶质细胞的CD200-CD200R抑制性信号轴,从而抑制小胶质细胞过度活化。2、HMGB1/CXCL12复合物在PD患者中存在,PD患者的损伤亦可能与上述机制相关。CXCL12与患者年龄的显著负相关提示靶向这一机制可能更适用于较早期的PD。