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糖基化修饰是最重要的蛋白质翻译后修饰之一,在细胞粘附、信号转导和免疫应答等生物学过程中扮演着重要角色。越来越多的研究表明糖基化修饰异常与一些疾病的发生、发展密切相关。已报导的疾病相关蛋白质生物标志物和药靶也多为糖蛋白。糖蛋白质组学也是蛋白质组学的重要组成部分和研究热点,主要包括大规模糖基化修饰位点(N-链接和O-链接)的鉴定、糖链组成和序列的分析、糖基化修饰水平的定量分析和比较等。由于糖基化蛋白占其总蛋白表达水平的比例较低,而且大多数糖蛋白是低丰度的膜蛋白,因此糖肽的富集是最关键的第一步。常用的N-糖肽富集方法主要包括酰肼法、凝集素法、亲水相互作用色谱法(HILIC)、二氧化钛法等。不同的实验室采用不同的富集策略,对这些方法的优劣没有统一定论。另外,定量糖蛋白质组学技术仍处于发展阶段,将最佳的糖肽富集技术和现有成熟的基于稳定同位素标记的定量蛋白质组技术相结合是目前的发展趋势,建立高效的定量糖蛋白质组学技术有助于深入理解蛋白质糖基化修饰在重要生物学过程中作用,也有助于加速疾病诊断或预后生物标志物以及和药物新靶标的发现。 论文第二章首次对目前常用的N-糖肽富集方法(包括酰肼法、凝集素法、二氧化钛法、HILIC和离子对HILIC法)进行了系统的比较、评价和优化。结果表明优化后的离子对HILIC法和其它富集方法相比具有较好的富集效果、较多的N-链接糖基化位点鉴定数目和最低的假阳性率。与凝集素法的串联实验进一步证明了离子对HILIC法能够独立有效的用于N-链接糖蛋白组学研究。 论文第三章建立了基于iTRAQ稳定同位素标记和离子对HILIC富集的定量N-链接糖蛋白质组学技术并应用于小鼠脑不同分区的N-糖蛋白质组学研究。基于优化后的标记-富集策略,系统比较分析了小鼠脑部七个主要功能区域的N-链接糖蛋白质组。共定量到1173个N-链接糖基化修饰蛋白质,2877个N-链接糖基化位点,首次建立了小鼠脑部七个主要脑功能区域的差异N-链接糖基化修饰谱,为深入了解糖基化修饰和脑功能区域的关系,以及脑部疾病奠定了分子基础。 论文第四章利用基于iTRAQ定量蛋白质组策略开展了巨噬细胞分泌液诱导肺癌细胞发生上皮间质转化前后的比较蛋白组研究。共发现了270个差异蛋白,其中包括154个上调和116个下调蛋白。生物信息学分析表明这些蛋白可能与肺癌的侵袭和转移密切相关。进一步的过表达和敲低等实验证明了差异蛋白CRYAB能有效影响肺癌细胞上皮细胞间质转化及侵袭和转移能力,有可能作为转移性肺癌治疗的潜在新靶点。