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胶质母细胞瘤是目前所知的致死率最高的中枢神经系统肿瘤,已有治疗策略的临床治疗效果不佳,患者平均生存期仅为12个月左右。目前针对胶质母细胞瘤治疗的难点首先是缺乏能够对肿瘤进展和患者预后进行有效评估的生物标志物,导致难以进行精准治疗;其次,作为“种子细胞”的胶质瘤干细胞是胶质母细胞瘤侵袭性生长、治疗抵抗及发生复发的根源,然而针对胶质瘤干细胞的有效靶标较为缺乏;此外,胶质母细胞瘤患者经常会对临床治疗的一线化疗药物替莫唑胺产生耐药性,导致其不能有效杀伤肿瘤细胞,治疗效果不佳。因此,找到能有效预测胶质母细胞瘤患者预后和自我更新能力的标志物并以此为基础优化替莫唑胺治疗方案将为胶质母细胞瘤的临床诊疗提供新的思路和方法。HOX是人体内一类调控生物形成的基因,共有4个家族。HOXA家族分子高表达于儿童胶质瘤耐药细胞,是下游耐药通路激活的重要标志。HOXA家族成员之一的HOXA5基因位于7号染色体上,在诱导胚胎发育和调控成体干细胞分化过程中发挥重要作用。本人硕士阶段研究发现HOXA5可能与胶质瘤干细胞生物学特性调控相关,然而,其调控胶质瘤进展及恶性生物学行为的机制尚待进一步研究。本研究基于胶质瘤干细胞、非胶质瘤干细胞和不同级别胶质瘤表达芯片进行差异表达分析,筛选出HOXA5作为关键的分子;通过免疫组化、二代测序及荧光原位杂交等技术检测了HOXA5在不同级别胶质瘤中表达及扩增情况,并探讨了其与胶质瘤患者预后的关系;探讨了HOXA5基因扩增在胶质瘤干细胞调控中的作用及机制;分析了HOXA5调控胶质瘤的侵袭能力以及其可能的机制;通过数据库分析发现了HOXA5与替莫唑胺耐药的关系,并进一步探讨了HOXA5促进替莫唑胺耐药的作用及机制。主要结果与结论如下:第一部分胶质瘤中HOXA5基因扩增及表达的临床病理学意义我们通过对不同级别胶质瘤进行差异表达分析,筛选发现HOXA5可以作为关键的分级指标。进一步分析了HOXA5在胶质瘤中的表达特征及扩增特点,联合临床资料分析了HOXA5与患者预后及临床指标的关系,主要方法、结果及结论如下:1.HOXA5基因扩增是胶质瘤临床分级与分型的重要依据,并可作为预测胶质瘤患者预后的独立影响因素（1）HOXA5是反映胶质瘤分级及患者预后的关键分子:我们在数据库中发现HOXA5作为与胶质瘤级别相关的关键分子,特别是其扩增与基因表达密切相关,提示HOXA5基因扩增在胶质瘤恶性生物学行为中的重要作用。（2）HOXA5基因在胶质母细胞瘤中的扩增情况:我们通过荧光原位杂交实验及二代测序分析发现HOXA5基因扩增是肿瘤细胞中的特异性事件。（3）HOXA5基因扩增与胶质瘤级别及分型密切相关:进一步数据库验证也发现HOXA5基因扩增比例随着胶质瘤级别增加而逐渐升高,且在不同组织分型和不同亚型胶质瘤中呈现差异扩增的情况。（4）HOXA5基因扩增与胶质瘤患者预后密切相关:通过对西南医院胶质瘤患者样本和TCGA、Rembrandt数据库分析发现不同级别胶质瘤中HOXA5基因扩增患者预后更差,且具有统计学意义。2.HOXA5基因扩增导致的基因表达增加具有重要的临床病理学意义（1）HOXA5基因扩增导致其表达增加:荧光原位杂交、免疫组化及Western blot实验发现HOXA5基因扩增与表达呈正相关,进一步数据库分析也发现HOXA5高表达富集的部分病例呈现出其基因扩增的现象。（2）HOXA5表达增加与胶质瘤级别密切相关,并可作为独立预后因素:通过对TCGA、Gravendeel数据库分析发现不同级别胶质瘤患者中HOXA5高表达预后更差,且具有统计学意义,而多因素生存分析也证实HOXA5表达是胶质瘤的独立的预后因素。以上结果证实HOXA5基因扩增是其基因表达增加的重要因素,也是判断胶质瘤级别与患者预后的重要指标,可能是恶性胶质瘤潜在的诊断治疗靶点。第二部分HOXA5对胶质瘤干细胞自我更新和侵袭能力的调控及机制HOXA5扩增作为胶质瘤恶性程度判断的重要因素,但是其调控胶质瘤恶性生物学行为的作用及机制仍不明确。此外,本课题组前期研究也发现HOXA5高表达可能与胶质瘤干细胞的功能相关。因此,本部分初步探讨了HOXA5对胶质瘤细胞的调控作用及机制,主要方法、结果及结论如下:1.HOXA5基因扩增与高表达是胶质瘤干细胞的重要特征（1）HOXA5高表达是胶质瘤干细胞的重要特征:我们首先通过GSEA分析发现HOXA5高表达组具有胶质瘤干细胞基因特征的富集;进一步分析发现HOXA5表达与胶质瘤干细胞标记物呈正相关,且具有共定位的现象。（2）HOXA5基因扩增是胶质瘤干细胞的重要特征:HOXA5探针检测发现胶质瘤干细胞中HOXA5基因扩增明细高于分化胶质瘤细胞,同时荧光原位杂交与免疫荧光双染实验也证实HOXA5基因扩增细胞呈现出胶质瘤干细胞标记物阳性表达的特征。2.HOXA5对胶质瘤干细胞自我更新和侵袭能力的调控:（1）敲低HOXA5表达显著抑制胶质瘤干细胞自我更新能力:通过极限稀释成球实验及胶质瘤干细胞比例检测发现敲低HOXA5表达后胶质瘤干细胞自我更新能力受到抑制。（2）敲低HOXA5表达显著抑制小鼠移植瘤的生长:小鼠原位移植瘤实验证明HOXA5表达与在胶质瘤体内生长速度和大小成正相关。（3）敲低HOXA5表达后胶质瘤干细胞的侵袭能力受到抑制:小鼠移植瘤切片HE染色结果提示HOXA5敲低后胶质瘤侵袭能力受到抑制,体外Transwell实验和侵袭能力指标检测也证实了这一结论。3.HOXA5调控胶质瘤干细胞自我更新和侵袭能力的机制（1）HOXA5正向调控PTPRZ1表达及两者联合分析的临床病理学意义:前期研究基础发现HOXA5结合在PTPRZ1启动子区域正向调控其表达。进一步研究发现敲低HOXA5表达后PTPRZ1阳性的胶质瘤干细胞比例降低,胶质瘤临床样本免疫组化染色分析也证实HOXA5与PTPRZ1表达正相关,联合两者表达对胶质瘤患者预后更具有预测价值。（2）HOXA5通过PTPRZ1调控胶质瘤干细胞自我更新能力和侵袭能力:通过检测干细胞标记物、极限稀释和成球实验发现敲低PTPRZ1表达能够部分回复由于过表达HOXA5造成的胶质瘤细胞“干性”增加的效应;Transwell实验及侵袭能力标记物表达检测也得到了类似的结果。进一步将PTPRZ1启动子区域HOXA5结合位点突变后的系列功能实验也证实了HOXA5调控胶质瘤干细胞自我更新能力和侵袭能力是通过与PTPRZ1启动子结合来实现的。以上结果证实HOXA5扩增调控胶质瘤干细胞自我更新及侵袭能力的重要作用,且其机制是通过调控PTPRZ1表达来实现的,两者的联合表达也具有更重要的预后价值。第三部分HOXA5促进胶质瘤替莫唑胺耐药的作用及机制已有研究结果显示HOXA家族在胶质瘤耐药细胞中高表达,而HOXA5对胶质瘤干细胞的调控作用进一步从侧面提示了HOXA5对胶质瘤细胞替莫唑胺耐药的影响。因此,本部分初步探讨了HOXA5对胶质瘤细胞替莫唑胺耐药的影响及机制,主要方法、结果及结论如下:1.HOXA5促进胶质瘤细胞替莫唑胺耐药及临床意义（1）胶质瘤细胞中HOXA5表达高低与替莫唑胺耐药性呈正相关:发现HOXA5表达与替莫唑胺IC50值呈正相关,且HOXA5在胶质瘤耐药细胞中高表达。改变HOXA5表达后凋亡信号通路相关分子表达升高,胶质瘤细胞IC50值降低,凋亡细胞比例增加,提示HOXA5对于维持胶质瘤细胞替莫唑胺耐药性的重要作用。（2）HOXA5在TMZ治疗中的临床病理学意义:通过TCGA数据库分析发现HOXA5可以作为预测替莫唑胺治疗效果的重要分子。（3）HOXA5与TMZ联用能有效抑制肿瘤生长并延长小鼠生存期:NOCD-SCID鼠原位移植瘤治疗实验表明敲低HOXA5与替莫唑胺联合治疗能够有效抑制肿瘤的生长并延长小鼠的生存期。2.HOXA5促进胶质瘤细胞替莫唑胺耐药的机制（1）生物信息学分析发现HOXA5与EZH2表达密切相关:数据库分析显示HOXA5与EZH2可能存在相互作用,进一步免疫荧光染色和免疫组化染色结果表明HOXA5与EZH2存在共定位现象,且两者表达正相关。（2）HOXA5与EZH2 CXC结构域结合进而调控胶质瘤细胞替莫唑胺耐药:CoIP实验结果表明HOXA5与EZH2相互作用,敲低HOXA5表达后EZH2及下游关键分子H3k27me3的表达也随之降低。通过检测凋亡信号通路相关分子和流式分析检测凋亡细胞比例发现敲低EZH2或者加入EZH2抑制剂均能部分回复由于过表达HOXA5所引起的替莫唑胺治疗效果减弱的效应。通过对EZH2全长片段进行截短分析发现其CXC结构域与HOXA5存在结合。（3）HOXA5调控EZH2引起耐药相关基因DNA甲基化导致其表达沉默:敲低HOXA5表达后发现EZH2关键下游分子H3k27me3被抑制,通过Ch IP-seq分析发现H3k27me3介导的DNA甲基化导致与替莫唑胺耐药相关基因表达沉默是HOXA5发挥替莫唑胺耐药效应的关键机制。以上结果明确了HOXA5调控胶质瘤细胞替莫唑胺耐药的作用,且其机制是通过与EZH2 CXC结构域结合催化下游基因H3k27me3的三甲基化修饰来实现的。综上所述,我们的结果首次证实了HOXA5基因扩增及表达与胶质瘤临床诊断、治疗和预后的关系,并首次发现HOXA5在维持胶质瘤干细胞表型及替莫唑胺耐药中的重要作用。机制研究方面,首次发现HOXA5通过结合在PTPRZ1启动子区域调控其表达进而调控胶质瘤细胞的自我更新能力和侵袭能力;同时,HOXA5也可与EZH2CXC结构域结合激活其下游经典分子H3k27me3的三甲基化修饰导致耐药性的产生。本研究结果为靶向胶质瘤干细胞及替莫唑胺的临床使用提供新思路和靶点。