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食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是一种常见的消化道恶性肿瘤,由于其起病隐匿且预后不良,现有的治疗手段不能显著改善食管鳞癌的预后。因此临床上迫切需要新型的治疗手段。长链非编码RNA在多种肿瘤的发生发展中起调控作用,长链非编码RNA00114能够促进结直肠癌的发生发展。在肝癌中,zeste基因增强子同源物2/肝癌缺失基因1轴(EZH2/DLC1)能够介导肝癌细胞的增殖、侵袭及凋亡途径。同时,有多种长链非编码RNA参与EC细胞的增殖及糖酵解过程,但长链非编码RNA00114在食管鳞癌中表达及作用机制研究较少。因此,本研究首先检测了LINC00114、EZH2和DLC1在食管鳞癌肿瘤组织、正常组织、食管癌细胞株和食管上皮细胞中的表达差异,并研究了该表达差异同EC细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡及糖酵解的关系。在第二部分实验中,我们通过sh-RNA和si-RNA技术分别干预LINC00114、EZH2和DLC1的表达以探究干预后EC细胞在体外的细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及糖酵解变化并在第三部分的免疫缺陷小鼠的移植瘤模型中验证了LINC00114和DLC1之间的作用机制。第一部分LINC00114在食管鳞癌中的表达及其对食管癌细胞生物学功能影响的研究目的:研究LINC00114在食管鳞癌中的表达情况及其对EC细胞生物学功能的影响。方法:采用RT-q PCR、Western blot等方法检测LINC00114在食管鳞癌组织、正常组织、肿瘤细胞株和食管上皮细胞中的表达;采用CCK-8法、集落形成法、Transwell法以及流式细胞术检测EC细胞在敲低LINC00114前后细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及糖酵解变化。结果:1.RT-q PCR分别检测LINC00114在食管鳞癌组织和正常组织中的表达,LINC00114在ESCC组织中的表达水平明显高于非肿瘤组织。与HEEC细胞株相比,食管癌细胞株TE1、Eca109、KYSE150和EC9706细胞株中LINC00114的表达显著上调,且LINC00114在Eca109和TE1细胞中的表达升高更为明显;2.利用lipo2000分别将sh RNA即sh-LINC00114-1和sh-LINC00114-2转染进入Eca109和TE1细胞中,两种质粒均可下调细胞株中LINC00114的表达水平,且sh-LINC00114-1的下调作用更为明显;CCK-8和克隆形成实验证实了下调LINC00114能够抑制食管癌细胞的增殖;3.Transwell实验证实下调LINC00114的表达能够抑制EC细胞的迁移和侵袭,流式细胞实验证实sh-LINC00114-1下调LINC00114能够显著促进Eca109和TE1细胞的凋亡;4.对肿瘤细胞中糖酵解的检测证实了LINC00114的下调可抑制食管癌细胞的生长和糖酵解。结论:LINC00114在食管鳞癌组织中的表达较正常组织高且在EC细胞中表达较食管上皮细胞高;在EC细胞中敲低LINC00114可抑制食管癌细胞的生长和糖酵解。第二部分LINC00114和EZH2与DLC1之间的关系及其在食管鳞癌中的分子机制研究目的:探讨LINC00114和EZH2与DLC1之间的关系及其在食管鳞癌中的分子机制方法:通过RT-q PCR和Western blot检测EZH2和DLC1在食管鳞癌组织及细胞株中的表达,分别评估EZH2和DLC1对食管癌细胞的增殖、迁移和糖酵解的影响;通过Ch IP验证LINC00114与EZH2和DLC1之间的作用机制;在体外分别下调EC细胞的LINC00114、EZH2、DLC1并采用CCK-8法、集落形成法、Transwell法及流式细胞术检测EC细胞在分别干预前后细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及糖酵解变化。结果:1.RT-q PCR和Western blot实验证实了EZH2在食管鳞癌组织中表达较正常组织明显增多,且其在Eca109和TE1细胞中表达较食管上皮细胞表达增强。通过转染靶向EZH2的sh RNA sh-EZH2-2下调了EZH2的表达,CCK-8和克隆形成实验证实了下调EZH2能够抑制食管癌细胞的增殖,Transwell实验显示下调EZH2能够显著抑制食管癌细胞的迁移,糖酵解的检测证实下调EZH2可抑制食管癌细胞的葡萄糖摄取,以上结论均与第一部分一致,表明EZH2与LINC00114之间可能存在关联。2.RNA pull-down实验显示LINC00114能够连接到EZH2上,且LINC00114能够在在免疫沉淀中富集,进一步探究显示,LINC00114能够与EZH2结合并通过H3K27me3途径影响DLC1的表达,进而影响ESCC细胞的活性。3.RT-q PCR分别检测了DLC1在食管鳞癌组织、正常组织、食管癌细胞株和食管上皮细胞中的表达,结果显示DLC1在食管鳞癌组织和食管癌细胞中表达水平显著低于其在癌旁正常组织和食管上皮细胞中的表达水平。下调DLC1的表达能够提高食管癌细胞的增殖能力。且DLC1的下调能够增强Eca109和TE1细胞的迁移和侵袭能力、葡萄糖摄取、乳酸生成和ATP生成。综上,DLC1可能是ESCC的抑癌基因。4.在食管癌细胞中特异性敲除DLC1后,食管癌细胞增殖和侵袭能力增强、葡萄糖摄取能力增强,即敲除DLC1可逆转sh-LINC00114在食管癌细胞中的作用。结论:沉默EZH2能够抑制EC细胞的生长并影响EC细胞的糖酵解,LINC00114能够通过与EZH2结合,募集H3K27me3在DLC1启动子中的富集而影响DLC1的表达;敲除DLC1可以促进EC细胞的生长和糖酵解并逆转sh-LINC00114对EC细胞生长和糖酵解中的抑制作用。第三部分LINC00114和DLC1在食管鳞癌移植瘤中的作用研究目的:评估LINC00114和DLC1在食管鳞癌移植瘤中的作用方法:将转染sh-LINC00114或si-DLC1的Eca109细胞在BALB/c裸鼠皮下建立移植瘤模型,评估肿瘤生长速度并检测肿瘤组织中DLC1表达;结果:1.sh-LINC00114转染后的Eca109细胞在BALB/c裸鼠皮下的生长速度显著降低,干扰DLC1的Eca109细胞的体内生长速度则明显升高。2.使用sh-LINC00114转染的Eca109细胞DLC1表达明显升高,肿瘤体积与DLC1的表达呈负相关。结论:sh-LINC00114显著降低了Eca109细胞的致瘤能力,而si-DLC1则显著加快了肿瘤的生长速度;免疫组化检测显示肿瘤中sh-LINC00114组DLC1表达升高,而si-DLC1抑制DLC1表达。