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第一部分microRNA-125a-5p与视神经炎的相关性研究目的筛选在视神经炎患者与正常对照组外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中差异表达的micro RNA,研究其与视神经炎患者视觉诱发电位(Visual evoked potential,VEP)以及光学相干断成像(Optical coherence tomography,OCT)表现的相关性。方法(1)qPCR检测视神经炎组与正常对照组入选对象的PBMCs中micro RNA-125a-5p、micro RNA-146a-5p、micro RNA-155和microRNA-326的相对表达量,筛选差异表达的基因。(2)F-VEP测量两组入选对象的P2波的峰时和振幅。(3)OCT测量两组入选对象的视乳头区四个象限视网膜全层厚度。结果(1)miR-125a-5p较其他入选的miRNAs(micro RNA-145a-5p、micro RNA-146a-5p、micro RNA-155和micro RNA-326)在视神经炎患者PBMCs中的表达明显下降(P<0.05)。(2)与正常对照组相比,视神经炎患者F-VEP P2波的峰时明显延迟(P<0.05),振幅明显下降(P<0.05),与miR-125a-5p表达量未见明显相关性。(3)与正常对照组相比,视神经炎患者OCT检查发现鼻、下和上三个象限视乳头区视网膜全层厚度明显升高(P<0.05),其中下方视网膜厚度值与视网膜miR-125a-5p的表达量呈中度负相关(R=-0.425,P=0.049)。结论miR-125a-5p在视神经炎患者外周血PBMCs中低表达,并与视乳头视网膜全层厚度呈中度负相关,其在视神经炎中的作用途径需要进一步机制研究明确。第二部分miR-125a-5p通过调节Treg细胞分化对实验性自身免疫性脑脊髓膜炎的影响目的通过实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型和淋巴细胞免疫模型探讨miR-125a-5p的表达变化对视神经炎的影响及其作用途径。方法1.体外实验(1)分离EAE小鼠脾内淋巴细胞,分成空白组、EAE组、EAE+miR-125a-5p过表达干预组(miR-125组)、EAE+miR-125a-5p过表达空载对照干预组(miR-125-Ctrl组)、EAE+miR-125a-5p-inhibitor干预组(miR-125i组)和EAE+miR-125a-5p-inhibitor空载对照组(miR-125i-Ctrl组),其中EAE组采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)诱导免疫脾淋巴细胞构建,miR-125组、miR-125-Ctrl组、miR-125i组和miR-125i-Ctrl组分别采用含有相应miRNA片段质粒的慢病毒进行转染干预。(2)各组细胞在二次转染72小时后进行荧光显微镜检查和流式细胞术检测,评估转染效率;进行流式细胞检测,观察对比T淋巴细胞各种亚型和B淋巴细胞比例的变化;进行ELISA检查,评估INF-γ、IL-4和IL-17炎症因子在细胞培养液中的表达。2.体内实验(1)将8周龄C57BL/6小鼠分成空白组、EAE组、EAE+miR-125a-5p过表达干预组(miR-125组)、EAE+miR-125a-5p过表达空载对照干预组(miR-125-Ctrl组)、EAE+miR-125a-5p-inhibitor干预组(miR-125i组)和EAE+miR-125a-5p-inhibitor空载对照组(miR-125i-Ctrl组),其中EAE模型采用MOG35-55诱导免疫C57BL/6小鼠构建,miR-125组、miR-125-Ctrl组、miR-125i组和miR-125i-Ctrl组分别采用含相应miRNA片段质粒的腺相关病毒进行转染干预。(2)从免疫造模时开始直至免疫后30天,隔日记录各组小鼠的体重和神经功能障碍评分(3)在免疫高峰期时分别对各组小鼠进行F-VEP检查,评估各组小鼠P2波峰时和振幅;以及进行OCT检查,评估各组小鼠视乳头区视网膜厚度变化。(4)在免疫高峰期时取小鼠眼球和视神经切片进行HE染色,观察对比炎症细胞浸润情况;取小鼠视神经进行q PCR检测,评估转染效率。取脾脏进行流式细胞检测,观察对比各种亚型T淋巴细胞和B淋巴细胞比例的变化。结果:1.体外实验(1)脾脏淋巴细胞体外培养的流式细胞术检测结果显示,与EAE组相比,miR-125组CD4+CD25+Foxp3+细胞群占比明显增加(P<0.05)。(2)ELISA检查,INF-γ、IL-4和IL-17炎症因子在miR-125组细胞培养液中的表达下调,其中INF-γ下降明显(P<0.05)。2.体内实验(1)在观察期内随时间延长,空白组和各实验组的小鼠体重均逐渐增加,各实验组小鼠的体重增幅较空白组小。各实验组小鼠在免疫后第9-13天发病,神经功能障碍评分在发病后7天左右达到最高值。(2)与空白组相比,各实验组组小鼠在免疫高峰时F-VEP P2波峰时延迟(P<0.05),振幅明显下降(P<0.05)。与EAE组相比,miR-125组小鼠P2波峰时延迟较少,差异有统计学意义(P<0.05)。OCT结果显示,与空白组对比,各实验组视乳头区视网膜厚度明显增加(P<0.05)。各实验组间比较,miR-125组小鼠视乳头区视网膜增幅较小,miR-125-Ctrl组、miR-125i组和miR-125i-Ctrl组小鼠视乳头区视网膜厚度差异无统计学意义。(3)小鼠视神经和视网膜HE染色发现,与空白组相比,各实验组炎症细胞浸润明显增多;miR-125组小鼠在各实验组间炎症细胞浸润相对较少,视神经纤维相对排列更整齐。小鼠脾单个核细胞流式检测发现,与EAE组相比,miR-125组CD4+CD25+Foxp3+细胞群占比明显增加(P<0.05)。结论miR-125a-5p可以抑制实验性神经炎小鼠的神经系统免疫反应,其主要通过调节Treg细胞分化,下调炎症因子的表达缓解实验性自身免疫性视神经炎的进程。第三部分miR-125a-5p靶基因的生物信息学预测目的通过在线靶基因预测网站预测靶基因交集以及基因功能富集分析和信号传导通路富集分析,探寻miR-125a-5p作用的靶基因,为进一步研究在视神经炎内环境下miR-125a-5p促进Treg细胞分化和调控炎症进程的作用途径提供科学依据。方法(1)采用在线靶基因预测数据库miRanda、Target Scan和Pic Tar预测miR-125a-5p的靶基因,使用R语言数据包提取其交集基因。(2)DAVID在线软件对miR-125a-5p的交集靶基因进行GO功能富集分析和KEGG信号转导通路富集分析。(3)TargetScan进行靶基因序列与miR-125a-5p种子序列的比对。结果(1)将在靶基因预测数据库miRanda、Target Scan和Pic Tar中所预测到靶基因进行交集,得到178个miR-125a-5p的靶基因。(2)GO分析预测显示靶基因交集富集具有显著性意义的生物进程是负性调节RNA聚合酶II启动子的转录功能、负性调节趋化作用、调节多细胞生物体的生长、调节semaphorin-plexin信号传导通路、负性调节轴突导向中的轴索延长、转录和DNA的模板化、胚胎后的发展、正性调节自噬、组织蛋白H3的乙酰化作用、造血作用以及蛋白质的多聚泛素化。KEGG信号转导通路富集分析预测的结果显示miR-125a-5p靶基因显著富集于肿瘤中micro RNA作用通路、m RNA监视通路、干细胞多能性调节通路和Epstein-Barr病毒感染通路。(3)SEMA4D参与了多项负性调节的生物学进程,并且Target Scanc搜索结果表明Aggregate PCT=0.97,其3’UTR区域的碱基与miR-125a-5p的种子序列匹配。结论生物信息预测分析获得178个miR-125a-5p的靶基因。其中3’UTR区域的碱基与miR-125a-5p的种子序列匹配的SEMA4D基因参与了多项负性调节的生物学进程,可作为后续研究的靶基因。第四部分miR-125a-5p靶向调控SEMA4D在实验性视神经炎中的机制研究目的采用双荧光素酶报告基因为主要手段进一步讨论miR-125a-5p是否通过SEMA4D在实验性视神经炎中发挥其对炎症的调节作用,为探讨miR-125a-5p在实验性视神经炎中的免疫调节作用提供科学依据。方法(1)构建和验证包含SEMA4D 3’-UTR片段及其变异序列的双荧光素酶报告基因质粒。(2)miR-125a-5p mimics和SEMA4D双荧光素酶报告基因质粒转染293T细胞,进行miR-125a-5p靶基因验证实验。(3)将脾细胞分选的Treg细胞分为EAE+miR-125a-5p过表达干预组(miR-125组)、EAE+miR-125a-5p过表达空载对照干预组(miR-125-Ctrl组)、EAE+miR-125a-5p-inhibitor干预组(miR-125i组),其中EAE细胞模型采用MOG35-55诱导免疫Treg细胞构建,miR-125组、miR-125-Ctrl组和miR-125i组分别采用含相应miRNA片段质粒的慢病毒进行转染干预。q PCR检测各组miR-125a-5p和SEMA4D基因表达量。(4)分离视神经炎组和正常对照组研究对象的PBMCs,采用q PCR检测各组miR-125a-5p和SEMA4D基因表达量。结果(1)双荧光素酶报告基因实验结果显示,与只转染了pmir GLO Vector-SEMA4D-3’UTR(Wt)质粒的对照组相比,共转染miR-125a-5p mimics和pmir GLO Vector-SEMA4D-3’UTR(Wt)质粒的SEMA4D(Wt)+miR-125a-5p组的报告基因荧光值显著减少(P<0.05)。(2)与对照组相比,miR-125组培养细胞miR-125a-5p的表达显著升高(P<0.05),而SEMA4D m RNA的表达显著下降(P<0.05)。miR-125i组培养细胞的miR-125a-5p的表达显著下降(P<0.05),SEMA4D m RNA的表达显著升高(P<0.05)。(3)和正常对照组相比,视神经炎患者的PBMCs中SEMA4D m RNA的表达显著增加(P<0.05)。结论在Treg细胞中,miR-125a-5p对它的靶基因SEMA4D具有调控作用,但其机制尚未明确。仍需进一步设计miR-125a-5p/SEMA4D通路的作用机制实验明确其对Treg细胞分化的影响和作用途径。