【摘 要】
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目的初步研究雷帕霉素（rapamycin,RAPA）对实验性自身免疫性重症肌无力（experimental autoimmune myasthenia gravis,EAMG）大鼠的治疗作用,旨在从细胞和分子水平探讨相关免疫机制,为临床治疗重症肌无力（myasthenia gravis,MG）提供实验室依据。方法（1）构建EAMG大鼠模型,分为CFA组、EAMG组、RAPA治疗组[1 mg/（kg
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目的初步研究雷帕霉素（rapamycin,RAPA）对实验性自身免疫性重症肌无力（experimental autoimmune myasthenia gravis,EAMG）大鼠的治疗作用,旨在从细胞和分子水平探讨相关免疫机制,为临床治疗重症肌无力（myasthenia gravis,MG）提供实验室依据。方法（1）构建EAMG大鼠模型,分为CFA组、EAMG组、RAPA治疗组[1 mg/（kg·d）];（2）采用Lennon肌力评分量表隔日评估各组大鼠临床症状并记录体重变化;（3）ELISA法检测大鼠周血清中抗R97-116抗体水平;（4）制备脾细胞悬液,分别给予5μg/m L Con A、10μg/m LR97-116、RPMI1640培养液处理,CCK-8法检测大鼠脾脏细胞的增殖活性;（5）流式细胞术检测各组大鼠脾脏中Th1细胞、Th17细胞、Treg的数量变化;（6）Western blot法检测脾脏中mTOR、p-mTOR、HIF-1α蛋白的表达量;（7）RT-q PCR检测脾脏中T-bet、RORγt、FOXP3、mTOR、HIF-1α、Glut1、PKM2的m RNA转录水平;（8）HE染色观察大鼠腓肠肌组织形态结构变化;（9）免疫荧光技术检测大鼠腓肠肌组织中Ach R的表达。结果（1）与CFA组大鼠相比,EAMG大鼠出现毛发干枯,体重下降,肌无力症状无好转,临床评分明显增加;较EAMG相比,RAPA治疗组大鼠体重和肌力明显改善,表明RAPA治疗可明显减轻EAMG大鼠的肌无力症状。（2）ELISA结果显示,与CFA组相比,EAMG组中抗R97-116抗体水平明显升高;与EAMG组相比,RAPA治疗组血清抗R97-116抗体水平显著降低。（3）CCK-8结果显示,在RPMI1640培养基、R97-116、Con A三种不同处理条件下,与CFA组相比,EAMG组细胞增殖活性明显增强;与EAMG组相比,RAPA组中的细胞增殖反应明显降低。（4）流式细胞术结果显示,与CFA组相比,EAMG组大鼠脾脏Th1、Th17细胞数量增加,Treg数量减少;与EAMG组相比,RAPA治疗组中大鼠脾脏Th1、Th17细胞数量明显减少,Treg数量增加。（5）RT-q PCR结果显示,与CFA组相比,EAMG组大鼠脾脏Th1和Th17相关细胞转录因子T-bet、RORγt的m RNA表达水平明显升高,而Treg相关细胞因子FOXP3的m RNA表达水平降低;与EAMG组相比,RAPA治疗组中T-bet、RORγt m RNA表达水平降低,而FOXP3的表达水平明显升高。（6）Western Blot和RT-q PCR方法检测脾脏组织中mTOR、p-mTOR、HIF-1α蛋白表达和m RNA水平,结果显示,与CFA组相比,EAMG组中p-mTOR、HIF-1α蛋白表达增加;与EAMG组相比,RAPA组中p-mTOR和HIF-1α蛋白表达减少,而mTOR总蛋白无明显变化。同时,RT-q PCR结果与Western Blot结果相符。（7）RT-q PCR检测脾脏组织中Glut1、PKM2基因的m RNA的表达水平。结果显示:与CFA组相比,EAMG组中Glut1、PKM2 m RNA的表达水平升高;与EAMG组相比,RAPA治疗组中Glut1、PKM2的m RNA表达水平降低。（8）HE染色结果显示,EAMG组大鼠肌纤维萎缩,结缔组织形成,可见大量炎性细胞浸润;而RAPA治疗组仍有少量炎性细胞浸润,但炎症程度明显减轻。（9）免疫荧光结果显示,EAMG组大鼠腓肠肌组织中Ach R含量明显减少,而RAPA治疗组中腓肠肌组织中Ach R含量增加。结论RAPA可减轻EAMG大鼠的肌无力症状。其机制可能与抑制mTOR/HIF-1α通路调节Th1/Th17/Treg细胞的平衡紊乱有关。
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