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越橘是重要的小浆果果树,果实中富含花色苷等多种生物活性物质,在国内外市场上引起广泛的重视和应用。然而,越橘花色苷的种类和含量因品种不同而存在差异。通过分子手段培育高花色苷含量的新品种已成为现在越橘育种的新方向。花色苷在ER上的多酶复合体中合成,储存在液泡中,其合成代谢通路研究较为清楚,但花色苷合成后转运、汇集的分子机制尚不清楚。最近鉴定的MATE转运蛋白属于多药转运蛋白家族,植物MATE转运蛋白参与花色苷从合成位点向储存位点的转运过程,它能识别花色苷,并通过自身构象的改变,将花色苷转运并积累在液泡内。挖掘花色苷转运相关基因并对其进行功能验证对于完善花色苷代谢途径及改良越橘品种具有重要意义。本研究以高丛越橘品种“北卫”为试材,基于越橘果实转录组文库筛选并克隆了8个高基因丰度、高表达丰度的MATE基因,并对其进行了生物信息学分析以及表达模式与花色苷积累间的相关性分析,并对其中一个最有可能参与花色苷转运的基因进行了亚细胞定位观察。结果如下:1、显微结构观察发现越橘果实中花色苷主要积累在果皮中,随着果实发育程度,花色苷积累量增加。越橘果实中存在运输花色苷的囊泡结构,伴随着果实成熟过程,囊泡间相互融合,成熟果皮细胞的液泡中分布着大量的花色苷液泡内涵体,整个果皮囊泡化。将筛选得到的All-Unigene进行Blast比对,发现转录组文库中存在与花色苷转运相关的GST、ABCC(MRP)和MATE的转录本。2、越橘果实转录组中筛选到33条被注释为MATE转运蛋白的Unigenes,20条在果皮中上调表达的Unigenes中19条为显著上调表达、13条在果肉中上调表达的Unigenes中10条为显著下调表达。3、通过染色体步移和RACE技术在越橘果实中克隆了8条高基因丰度、高表达丰度的MATE基因的全长cDNA序列,分别命名为VcMATE1、VcMATE2、VcMATE3、VcMATE4、VcMATE5、VcMATE7、VcMATE8和VcMATE9,提交到GenBank,登陆号分别为:KF875433、KF831422、KF875434、KF875435、KF875436、KF875438、KF875439和KF875440。4、预测这些VcMATE蛋白由477~517个氨基酸残基组成,分子量在54 kDa左右,理论等电点在5.35~8.41之间。经预测这些蛋白定位于质膜上,N端不存在信号肽序列,TMMTOP预测VcMATEs有8~12个跨膜螺旋,TMHMM预测VcMATE5外,其余VcMATEs都有12个跨膜螺旋。5、多重序列比对显示8个VcMATEs序列一致性在32.1~84.4%之间,有5个保守结构域。其中VcMATE2、VcMATE3、Vc MATE5、VcMATE7、VcMATE8和VcMATE9与MATE型类黄酮转运蛋白序列更加相似。尤其是VcMATE2含有全部的TT12型MATE蛋白所特有的保守氨基酸残基。6、聚类分析结果显示,MATE转运蛋白可分为功能不同的5类,越橘中8个VcMATE蛋白分布在其中的两组中。VcMATE2、VcMATE3、VcMATE5、VcMATE7、VcMATE8和VcMATE9与MATE型类黄酮转运蛋白聚为一类,表明它们可能参与类黄酮化合物的转运。而VcMATE1和VcMATE4与一些离子或药物排出蛋白聚为一类,说明它们可能参与次级代谢物质、异源物质或有毒离子的排出。7、实时荧光定量PCR结果显示8个VcMATEs基因具有不同的时空表达模式。VcMATE2表达量是8个基因中表达量最高的,表达量最高的部位在富含花色苷的蓝果果皮中,其次是根,果实发育过程中呈现增高的趋势。VcMATE3、VcMATE8和VcMATE9与VcMATE2有相似的表达模式。VcMATE5和VcMATE7主要在根中表达,且在种子中的表达量都高于果皮。VcMATE1和VcMATE4总体的转录水平要比其它基因低很多,且最高的表达部位在果肉。8、在VcMATE基因表达与花色苷积累进行相关性分析,结果显示VcMATE2、VcMATE3、VcMATE8、VcMATE9的表达情况与花色苷积累达到极显著相关,加之,VcMATE2的表达水平最高,因此推测VcMATE2可能是越橘果实中花色苷的跨膜转运的主要基因。9、免疫组织化学定位结果显示VcMATE2定位在蓝果果皮细胞的外周,VcMATE2::YFP融合蛋白转化拟南芥原生质体显示VcMATE2定位在液泡膜上。