研究背景和目的结直肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一。近年来,由于我国人民生活水平的改善和饮食结构的调整,结直肠癌的死亡率在我国所有癌症中高居第三,且其发病年龄有逐渐年轻化的趋势。结直肠癌的发生发展是一个多步骤、多阶段的过程,而这一过程中仍有许多未知的领域需要我们去探究。尽管目前在结直肠癌的诊断和治疗上已经取得了长足的进步,但是发生了远处转移的结直肠癌患者预后仍然很差,临床上多数结直肠癌患者在进行根治性手术前己出现微转移,并且是结直肠癌术后转移和复发的直接原因,这也促使我们去进一步探究结直肠癌的发生发展过程和其生物学特性以寻找有效的治疗靶点来改善结直肠癌患者的预后。Sam68(Src—associated during mitosis of68KD)作为信号转导和RNA激活蛋白(STAR)成员之一,自发现以来便由于其在肿瘤发生发展中所起的作用而受到关注。人类Sam68基因定位于1p32,通过KH结构域与RNA结合,在细胞分裂期是Src蛋白酪氨酸激酶的底物。Sam68在调控信号转导、基因转录等方面发挥重要的作用,它还能调控CD44, Bcl-x1,SMN2, SF2/ASF和Cyclin D1等多种肿瘤相关基因的选择性剪接。结直肠癌的发生与发展是一个多基因参与、多因素相互作用并经过多个阶段最终形成的极其复杂的生物学过程。通过发现癌基因和抑癌基因的存在以及对细胞信号传导通路机制的逐步阐明,极大地丰富了人类在细胞癌变机制领域的认识。在这其中,APC及MCC基因突变、MMR基因的失活、K-ras基因突变、抑癌基因DCC的缺失、抑癌基因p53的突变与缺失等一系列改变的分子遗传学模式是结直肠癌发生发展的经典分子遗传学模式。国内外研究报道指出,Sam68在正常人体中广泛表达,在信号转导、基因转录、选择性剪接中发挥重要作用。另外Sam68在不同的细胞类型中对细胞周期,细胞增殖和转化,肿瘤发生和转移有促进作用,参与了人类肿瘤相关基因表达转录及转录后的调控。BusaR等证实在前列腺癌组织中,Sam68在蛋白质和mRNA水平都存在着不同程度的表达上调,而在前列腺癌细胞中下调Sam68会导致细胞周期延缓,细胞增殖能力降低。近年有研究指出,在乳腺癌、宫颈癌、肾细胞癌和非小细胞肺癌中,Sam68的表达上调,对这些肿瘤的发生发展起促进作用,且与这些癌症患者的低存活率密切相关。而在体外实验中,下调Sam68能抑制乳腺癌和鼻咽癌细胞的增殖能力及宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力。以上结论表明Sam68很可能具有癌基因的特性,但Sam68在结直肠癌中的具体作用目前尚未明确。在前期实验中,我们研究发现Sam68在结直肠癌组织中表达上调,且Sam68的高表达与结直肠癌的强临床侵袭性、低分化程度和预后不良密切相关,但Sam68在体外对结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力的影响目前国内外尚未见报道。本研究通过建立Sam68稳定过表达和稳定干扰Sam68的结直肠癌细胞株,检测Sam68对结直肠癌细胞体外增殖、侵袭和迁移能力的影响,进一步探讨Sam68在结直肠癌发生发展和转移过程的作用,以期为结直肠癌的分子靶向治疗提供新的思路。方法1.构建携带人Sam68基因的逆转录病毒载体pbabe/Sam68首先,我们以含人Sam68cDNA的质粒为模板进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳后用试剂盒回收纯化,以BamHI和EcoRI为酶切位点双酶切Sam68cDNA回收产物和pbabe空载体,然后将酶切产物T4连接酶16℃连接8h,转化,涂LB/AMP板37℃过夜培养,挑取阳性克隆提取质粒,经酶切及PCR鉴定后测序,命名为pbabe/Sam68。2.构建过表达Sam68稳定细胞株及过表达Sam68对结直肠癌细胞生物学特性的影响我们利用慢病毒感染的方法将Sam68和vector分别稳定表达于结直肠癌细胞株SW480和Ls174t中。首先运用PCR法扩增目的基因Sam68,与空载体pbabe连接后,构建携带人Sam68基因逆转录病毒载体pbabe/Sam68,经293FT病毒包装细胞后,产生重组逆转录病毒,感染相对低表达Sam68的结直肠癌细胞株SW480和Ls174t,用含空载体的病毒做对照。用嘌呤霉素筛选稳定的细胞克隆,得到稳定过表达Sam68的细胞株(SW480/Sam68、Ls174t/Sam68),及阴性对照细胞株(SW480/vector、Ls174t/vector).利用荧光定量PCR和Western blot法鉴定转染后Sam68在细胞中的蛋白表达水平,利用MTT法、平板克隆形成实验和Transwell侵袭实验检测Sam68转染前后对结直肠癌细胞体外增殖、侵袭和迁移能力的影响。3.干扰Sam68稳定细胞株的构建及Sam68表达沉默对结直肠癌细胞生物学特性的影响我们利用慢病毒感染的方法将shRNA-Sam68和scramble分别稳定表达于结直肠癌细胞株SW620和HCT116中。首先将携带人Sam68基因RNA干扰的逆转录病毒载体pSuper/shRNA-Sam68用293FT病毒包装细胞,产生重组逆转录病毒,感染相对高表达Sam68结直肠癌细胞株SW620和HCT116,用含空载体的病毒做对照。用G418筛选抗性克隆,得到稳定干扰Sam68的细胞株(SW620/shSam68、 Ls174t/shSam68),及阴性对照细胞株(SW620/scramble、HCT116/scramble)。用荧光定量PCR和Western blct法检测细胞中干扰Sam68后的蛋白表达水平。利用MTT法、平板克隆形成实验和Transwell侵袭实验检测干扰Sam68前后对结直肠癌细胞体外增殖、侵袭和迁移能力的影响。4.统计学处理所有数据采用SPSS13.0统计软件进行统计处理,各组实验数据用平均值士标准差(means±SD)表示,MTT法结果采用析因方差检验分析,两组间比较采用独立样本t检验(Independent-Samples T Test),取P<0.05为差异有统计学意义。结果1.构建过表达Sam68逆转录病毒载体以含人Sam68cDNA的质粒为模板进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳后用试剂盒回收纯化,通过双酶切,将Sam68基因克隆至pbabe质粒,经酶切及测序鉴定,确定构建人Sam68基因的逆转录病毒表达载体pbabe/Sam68。2.构建稳定过表达Sam68的结直肠癌细胞株及鉴定我们将上述所得到的过表达Sam68的逆转录病毒载体pbabe/Sam68通过慢病毒感染法转染SW480和Ls174t细胞,得到稳定过表达Sam68的细胞株(SW480/Sam68、Ls174t/Sam68),及阴性对照细胞株(SW480/vector、Ls174t/vector)。用荧光定量PCR和Western blot法检测Sam68的蛋白表达水平。我们分别用荧光定量PCR和Western blot法对过表达Sam68组细胞和阴性对照组进行检测后发现,稳定转染重组质粒pbabe/Sam68后的SW480和Ls174t细胞组较对照组mRNA和蛋白表达含量明显增多。结果表明,我们成功建立了过表达Sam68的稳定细胞株。3.过表达Sam68对结直肠癌细胞生物学特性的影响我们通过MTT法观察过表达Sam68基因后体外细胞的增殖情况,发现与转染pbabe/vect。r的SW480和Ls174t细胞相比,转染pbabe/Sam68的SW480和Ls174t细胞的增殖速度显著增快,并且呈时间依赖关系(F=214.333,P<0.001；F=1418.465,P<0.001)。克隆形成实验显示转染pbabe/Sam68后SW480和Ls174t细胞的活力与对照组细胞相比显著增加,差异具有统计学意义(t=-27.954,P<0.001；t=-13.937,P<0.001)。采用Transwell、室侵袭实验检测过表达Sam68后结直肠癌细胞体外侵袭、迁移能力的变化,结果显示SW480/Sam68细胞组穿膜细胞数多于SW480/vector细胞组,穿膜到达下室的SW480细胞均数分别为2444±19.80和89±5.66,2组相比差异具有显著性(t=-10.645,P=0.009)。以上结果说明Sam68表达水平上调后,结直肠癌细胞体外增殖、侵袭和迁移能力均显著增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.构建稳定干扰沉默Sam68的结直肠癌细胞株及鉴定我们将携带人Sam68基因RNA干扰的逆转录病毒载体pSuper/shSam68通过慢病毒感染法转染SW620和HCT116细胞,得到稳定干扰Sam68的细胞株(SW620/Sam68、HCT116/shSam68),及阴性对照细胞株(SW620/scramble、 HCT116/scramble),用Western blot法检测Sam68的蛋白表达水平。我们分别用荧光定量PCR和Western blot法对干扰Sam68组细胞和阴性对照组进行检测后发现,稳定转染干扰Sam68的重组质粒pSuper/shRNA-Sam68后的SW620和HCT116细胞组较对照组rRNA和蛋白表达明显降低。结果表明,我们成功建立了干扰Sam68的稳定细胞株。5.干扰沉默Sam68对结直肠癌细胞生物学特性的影响我们通过MTT法观察干扰Sam68基因表达后体外细胞的增殖情况,发现与转染pSuper/scramble的细胞相比,转染pSuper/shSam68的SW620和HCT116细胞的增殖速度显著减慢,并且呈时间依赖关系(F=255.176,P<0.001；F=93.194,P<0.001)。克隆形成实验显示转染pSuper/shSam68后SW620和HCT116细胞的活力与对照组细胞相比显著下降,差异具有统计学意义(t=9.155,P=0.001；t=8.763,P=0.001)。采用Transwell小室侵袭实验检测干扰Sam68后结直肠癌细胞体外侵袭、迁移能力的变化,结果显示SW620/shSam68细胞组穿膜细胞数少于SW620/scramble细胞组,穿膜到达下室的SW620细胞均数分别为112.5±17.68和372±11.31,2组相比差异具有显著性(t=17.486,P=0.003)；同样地,HCT116/shSam68细胞组穿膜细胞数少于HCT116/scramble细胞组,穿膜到达下室的HCT116细胞均数分别为49.5±10.61和178±2.83,2组相比差异具有显著性(t=16.555,P=0.004)。以上结果说明Sam68表达水平下调后,结直肠癌细胞体外增殖、侵袭和迁移能力均被显著抑制,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论Sam68与结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移能力密切相关,提示Sam68基因在结直肠癌的发生发展及转移过程中起到重要的作用。本研究的创新之处构建了Sam68的过表达载体,建立了稳定过表达Sam68和稳定干扰沉默Sam68的结直肠癌细胞株。