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研究背景:肿瘤微环境可以通过复杂的机制有效抑制肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞的密度和效应功能,达到免疫逃逸的目的。近年来发现T淋巴细胞表达多种共抑制性免疫检查点受体,包括PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3等,是肿瘤抑制浸润的效应T淋巴细胞的重要机制之一。免疫检查点PD-1/PD-L1阻断治疗被认为是晚期非小细胞肺癌（NSCLC）治疗中最重要突破之一。然而由于肿瘤微环境的异质性,包括肿瘤微环境浸润免疫细胞成分和状态的差异,PD-1/PD-L1抑制剂仅对部分晚期肺癌患者有显著疗效。肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞的密度、分布和功能状态是影响免疫治疗疗效的关键因素。因此,鉴别和研究肿瘤浸润CD8+细胞亚群,将有助于寻找预测免疫检查点治疗疗效的标志物,挖掘新的免疫治疗靶点,从而进一步扩大肺癌免疫治疗获益人群。肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞研究最多、最为深入的是表达高水平PD-1的耗竭型CD8+T淋巴细胞（exhausted CD8+T cells）。抗PD-1/PD-L1抗体阻断PD-1传导的抑制T淋巴细胞功能的信号通路,从而恢复耗竭T淋巴细胞免疫应答功能,发挥它们的肿瘤杀伤作用。但是,肿瘤组织中PD-1阳性的CD8+T淋巴细胞并非都为耗竭的T淋巴细胞。原始幼稚的T淋巴细胞在经受抗原的刺激后会进一步分化成为效应T淋巴细胞,其中表达CD57分子的T淋巴细胞具有较高的细胞毒性能力。例如,慢性感染过程中反复的抗原刺激会促进CD8+CD57+T淋巴细胞的形成和积累,并在抗慢性病毒感染中起到重要作用。然而,这群细胞在抗肿瘤免疫中的具体作用尚不清楚。研究目的:系统性研究CD8+CD57+T淋巴细胞在非小细胞肺癌患者外周血、肿瘤组织、淋巴结中的细胞表型和免疫效应功能。揭示促进肿瘤浸润CD8+CD57+T淋巴细胞免疫效应功能的关键分子,挖掘新的免疫治疗靶点,从而进一步扩大肺癌免疫治疗获益人群。实验方法:本研究选取武汉同济医院胸外科非小细胞肺癌患者肿瘤组织、外周血以及淋巴结。为避免胶原酶对淋巴细胞表型的影响,利用机械法获取单细胞悬液,采用密度梯度离心的方法分别从外周血、肿瘤组织、淋巴结中提取单个核细胞（PBMC）、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）、淋巴细胞。多选磁珠的方法分离和纯化CD8+CD57+以及CD8+CD57-T淋巴细胞。利用PMA+Ionomycin或anti-CD3+anti-CD28的方法进行培养和活化混合淋巴细胞。基于细胞系重组定向T淋巴细胞毒性测定的办法分别检测CD8+CD57+和CD8+CD57-T淋巴细胞的靶细胞杀伤能力。流式细胞分析技术对CD8+T淋巴细胞表型、功能、细胞增殖能力以及相关转录因子进行分析。RT-q PCR和Western blot技术验证干扰素γ调控IL-15的表达及其机制。实验结果:CD8+CD57+T淋巴细胞在肿瘤组织中占总CD8+T淋巴细胞的比例低于其在外周血中的比例（15.10%±7.74%vs 19.04%±10.53%）;相比外周血和肿瘤组织,淋巴结中的CD8+CD57+T淋巴细胞的比例最低,约占6～8%。抗原激活的CD8+T淋巴细胞可以形成多种类型的记忆细胞和效应T淋巴细胞。根据T淋巴细胞是否表达CD27、CD28、KLRG-1等可以初步判断T淋巴细胞所处的分化阶段。在细胞分化和功能成熟过程中,缺失CD27和CD28的表达,但是获得KLRG-1表达的细胞属于终末分化效应细胞,并具备成熟的免疫应答功能。在外周血当中,CD8+CD57+T淋巴细胞几乎不表达CD27和CD28,表达高水平的KLRG-1。但是,在淋巴结和肿瘤组织中的CD8+CD57+T淋巴细胞有部分细胞表达CD27和CD28分子,尤其是淋巴结当中的CD8+CD57+T淋巴细胞;并且肿瘤组织和淋巴结当中的CD8+CD57+T淋巴细胞都不表达KLRG-1。利用经典CD45RA和CCR7表达状况研究这群细胞所处分化阶段。我们发现,在肿瘤组织和淋巴结当中,大于90%的CD8+CD57+T淋巴细胞为效应记忆T淋巴细胞（CD45RA-CCR7-,TEM）;而在肿瘤患者外周血中,50%左右CD8+CD57+T淋巴细胞为终末分化表达CD45RA的效应细胞（CD45RA+CCR7-,TEMRA）。肿瘤浸润CD8+CD57+T淋巴细胞在细胞表型上不同于耗竭型T淋巴细胞,前者不表达LAG-3、TIM-3、CTLA-4等免疫检查点分子。细胞毒活性分析发现,离体的淋巴结和肿瘤中组织的CD8+CD57+T淋巴细胞不具有细胞杀伤功能,而外周血中的CD8+CD57+T淋巴细胞可诱导20～30%P815细胞早期凋亡。进一步研究这群细胞效应分子和相关转录因子的表达,我们发现肿瘤组织和淋巴结中的CD8+CD57+T淋巴细胞穿孔素表达障碍,与T淋巴细胞分化和功能密切相关的转录因子T-bet表达低下。IL-15作为重要细胞因子,与CD8+T淋巴淋巴细胞的分化和功能有关。肿瘤微环境IL-15对肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞的维持有重要作用。我们体外实验发现,干扰素γ能够通过JAK/STAT1/IRF-1途径上调肿瘤细胞IL-15的表达水平。利用外源IL-15能够显著提高肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞穿孔素和T-bet的表达,从而增强这群细胞的杀伤能力。结论:综上结果提示肿瘤组织中存在不完全分化的效应CD8+CD57+T淋巴细胞。肿瘤微环境可能导致CD8+CD57+T淋巴细胞分化受阻和功能障碍。IL-15能够促进肿瘤浸润的CD8+CD57+T淋巴细胞分化和免疫应答,而干扰素γ能够通过JAK/STAT1/IRF-1通路上调肿瘤细胞IL-15的表达水平。我们的研究工作一方面揭示肿瘤免疫逃逸新机制,即肿瘤微环境阻碍活化T淋巴细胞的完全分化和功能成熟;另一方面,IL-15可以促进这群细胞分化和功能成熟。因此,本研究为免疫检查点抑制剂联合IL-15提高免疫治疗的有效率提供了一定的理论基础和新的思路。