研究背景:放射治疗是盆腔恶性肿瘤的重要治疗手段之一。虽然临床上已采用三维适形放疗和调强放疗,但肿瘤附近的健康组织仍不可避免受到辐照,导致放射性损伤发生。肠道是电离辐射损伤最敏感的器官之一。远端肠道距离盆腔较近,在盆腔放疗时容易受到损伤。放射性肠损伤病程长、治疗难度大,不仅严重影响患者的生活质量,还可能对患者的生命安全构成威胁。电离辐射诱导产生的活性氧（reactive oxygen species,ROS）是放射损伤发生的重要因素之一,能够诱导DNA损伤和细胞死亡等。因此,清除电离辐射诱导产生的ROS是放射性肠损伤防治的一种有效手段。碳化聚合物点（Carbonized polymer dots,CPDs）是一种新型的碳基纳米材料,具有良好的生物安全性、易于制备和改造等优点,已成为生物医学领域最有前途的纳米材料之一。很多研究发现碳化聚合物点具有ROS清除能力,可以减轻细胞和组织的氧化应激损伤。研究目的:制备一种口服的、缓控释的、具有ROS清除能力的新型碳化聚合物点纳米材料,系统评估该纳米材料对放射性肠损伤的防护作用。研究方法:1.以谷胱甘肽为主要原料,利用反应釜制备具有ROS清除能力的、硫掺杂的、红色荧光的、新型碳化聚合物点（S-doped red fluorescent carbonized polymer dots,S-rCPDs）纳米材料,并对材料进行表征。在细胞水平上,使用共聚焦显微镜检测S-rCPDs的细胞吸收和分布。采用CCK-8评估S-rCPDs的细胞毒性。S-rCPDs对细胞的辐射防护作用及机制的研究方法包括:通过CCK-8、活死染色和克隆形成实验评估细胞活性,利用DCFH-DA检测细胞内活性氧水平,采用彗星实验评估DNA损伤情况。2.采用微流控技术,用丙烯酸树脂聚合物包裹S-rCPDs制备成缓控释的纳米微球（S-rCPDs@MPs）,并对材料进行表征。在动物水平上,利用血常规、血生化和重要器官的组织学检查评估S-rCPDs@MPs的体内安全性。用小动物荧光成像仪对比口服S-rCPDs@MPs和S-rCPDs后的体内分布情况。采用腹部辐照方式构建小鼠放射性肠损伤模型。通过小鼠体重、粪便粘稠度、便中带血情况和远端肠道的苏木精-伊红染色（H＆E）评估S-rCPDs@MPs对急性放射性肠损伤的保护作用。利用H＆E和Masson染色检测辐照后3个月小鼠的远端肠道,评估S-rCPDs@MPs对慢性放射性肠损伤的保护作用。采用TUNEL染色、Caspase-3免疫组织化学、肠系膜血流量检测和TGF-β1 mRNA的表达水平,研究S-rCPDs@MPs的抗放射性肠损伤机制。利用裸鼠肿瘤模型检测SrCPDs@MPs对肿瘤生长及放疗疗效的影响。3.对空白对照组、X射线组、S-rCPDs@MPs+X射线组的小鼠肠道进行转录组测序分析。首先筛选不同组别间的差异表达基因。再者,利用基因富集分析方法分析不同组别间的富集通路,检测电离辐射影响的富集通路以及SrCPDs@MPs对这些通路的影响。最后,利用免疫组织化学对基因富集分析的结果进行验证。4.基于16S r RNA测序,从菌群角度探索S-rCPDs@MPs的辐射防护机制。利用α多样性分析和β多样性分析对比3组样本差异,利用线性判别分析筛选相对丰度较高的差异菌群。研究结果:1.成功制备了S-rCPDs,其平均粒径2.2nm,自发深红至近红外荧光,具有ROS清除能力。细胞水平上,S-rCPDs的细胞毒性小,能够被细胞摄取并可以进入细胞核。与X射线组相比,S-rCPDs+X射线组的细胞内的ROS水平低、DNA损伤少、细胞活性强、死亡细胞少。2.成功制备了口服的、缓控释的纳米微球（S-rCPDs@MPs）,其平均粒径130μm,p H高于5.5时开始崩解释放S-rCPDs。动物水平上,S-rCPDs@MPs体内安全性良好。口服8小时后,与S-rCPDs相比,S-rCPDs@MPs在远端肠道富集更多。成功构建了放射性肠损伤小鼠模型。与X射线组相比,SrCPDs@MPs+X射线组小鼠体重大、疾病活动指数评分低、肠绒毛损伤轻、肠黏膜下层纤维化程度轻、肠隐窝细胞凋亡数量少、肠系膜血运好、肠组织的TGF-β1 mRNA表达水平低。S-rCPDs@MPs即不促进肿瘤生长,也不会影响放疗对肿瘤的杀伤作用。3.转录组测序,X射线组vs空白对照组共发现4219个差异表达的基因,而S-rCPDs@MPs+X射线组vs空白对照组共发现2432个差异表达的基因。辐照后前15个富集的KEGG通路中细胞因子和细胞因子相互作用通路富集分数最高,给予S-rCPDs@MPs预处理后,辐照组前15个富集的KEGG通路中有11个通路不再富集。远端小肠的免疫组化分析显示,S-rCPDs@MPs预处理后,NF-κB、IL-1β和CD68表达水平显著降低。S-rCPDs@MPs+X射线组vs X射线组的富集分析结果显示,核苷酸切除修复、碱基切除修复、错配修复通路在SrCPDs@MPs+X射线组中富集。4.菌群测序,辐照后α多样性的chao1指数、shannon指数、observed species指数、simpson指数均有下降趋势,给予S-rCPDs@MPs预处理后chao1指数、shannon指数、observed species指数、simpson指数均有升高趋势;β多样性的PCA和PCo A分析显示,空白对照组、X射线组、S-rCPDs@MPs+X射线组这三组区分明显,S-rCPDs@MPs+X射线组距离空白对照组更近。线性判别分析显示X射线组中优势菌群有肠杆菌,S-rCPDs@MPs+X射线组的优势菌群主要是乳酸杆菌。研究结论:1.本研究成功制备了一种口服的、缓控释的、具有ROS清除能力的、自发近红外荧光的新型碳化聚合物点纳米微球（S-rCPDs@MPs）。2.S-rCPDs@MPs的生物安全性良好,口服后在远端肠道富集,可以抑制小鼠放射性肠损伤。3.S-rCPDs@MPs可以减少肠隐窝细胞凋亡,减轻肠系膜血管内皮损伤,抑制肠组织TGF-β1 mRNA表达。4.S-rCPDs@MPs可以控制细胞因子风暴,减轻DNA损伤并促进损伤的DNA修复。5.S-rCPDs@MPs可以保护肠道菌群的多样性,增加益生菌相对丰度,其中乳酸杆菌可能是S-rCPDs@MPs抗辐射损伤的关键菌群。