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烟草病毒病发生普遍且危害严重。为从根本上防治烟草病毒病，并且快速而准确地检测出烟草上常见的四种病毒，本研究根据RNAi原理构建了能够产生发夹状转录物的植物表达载体，通过农杆菌侵染法得到转基因烟草，并对转基因烟草的抗性进行了检测；此外，建立了常见四种病毒的四重RT-PCR检测方法，并对该检测方法进行了评价和初步应用。主要研究结果如下：
1.通过对GenBank中4种病毒(TMV、CMV、PVY、PVX)的多条基因组全长序列进行比对，筛选到4种病毒在基因组范围内的相对保守区域。最终选定各病毒序列，连接成800bp的嵌合基因。依此构建了嵌合基因的RNAi植物表达载体，通过农杆菌转化普通烟草，获得转基因植株。经PCR检测，共得到转化成功的植株30株，转化成功率85.7％。转基因植株(PCR阳性)对病毒的抗性显著强于对照植株。非转化植株和空载体转化植株对照很快显示病毒侵染症状，并且不久后死亡；转化植株表现症状明显迟于对照植株，接种30天后，仍有1/3的植株未显示症状。ELISA结果显示，～部分PCR检测阳性的植株对其中1至2种病毒产生了抗性，但没有表现出同时抗3种病毒侵染的免疫特性。
2.通过一系列实验，最终确定一步法三重RT-PCR检测CMV、TMV和PVY的条件：Taq酶2U/25μL，MgC122mmol/L，dNTP200或250μmol/L，Tris-HCI(pH8.3)和KCI分别为15和75mmol/L;TMV、CMV引物浓度为0.04μmol/L，PVY引物浓度为0.4μmol/L。退火温度500C，循环数29或30。在三重RT-PCR的实验基础上，通过改变各个实验参数，得到了能够同时扩增出四种病毒(CMV、TMV、PVY和TEV)的一步法多重RT-PCR体系。后续实验表明，本实验的四重RT-PCR特异性较强，不会出现非特异条带。同时，灵敏度实验表明，该四重RT-PCR的检测灵敏度比单重RT-PCR总体上低～个数量级。对田间采集的病毒样本的检测表明，本实验得到的～步法四重RT-PCR体系能够用于这四种病毒的检测。