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本室前期的研究,已经从双胸蚓组织中提取获得了5种核酸酶样酶,分别命名为EWD1,2,3和EWN1,2。并对这些酶的酶学动力学性质、影响因素、底物特异性等方面进行了研究。根据这些酶的来源、分子量、等电点、层析和电泳等行为以及底物特异性等,初步证明,我们新近发现了双胸蚓组织中存在着多种核酸酶样酶。为了进一步确证这些新发现的蛋白质的本质和结构,获得其编码基因,本研究应用蛋白质色谱分离纯化技术,PAGE / SDS-PAGE(1-D)、2-D PAGE/2-D SDS-PAGE、蛋白质化学、MALDI-TOF-MS、LC-MS/MS、基因文库、RT-PCR等技术分5个层次对EWD1、EWD2和EWD3进行了研究。一、高纯度双胸蚓核酸酶的制备:进行蛋白质氨基酸组成和序列的分析需要较大量高纯度(99.5%以上)的酶样品,本研究通过高效液相离子交换色谱层析与1-D PAGE、2-D PAGE电泳分离相结合,采用非变性咪唑-锌反染色法、胶内回收,分别获得了大于99.5%纯度的EWD1、EWD2和EWD3,建立了这些蛋白的可行的高纯度分离纯化方案,得率分别为27.9%(EWD1)、16.7%(EWD2)、16.7%(EWD3),纯化倍数分别为11.6 (EWD1)、11.2 (EWD2)、18.6(EWD3)。为进一步的研究提供了样品基础。二、双胸蚓核酸酶(EWDs)蛋白质表征的研究:采用基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱法(MALDI-TOF-MS),进一步鉴定了三种蛋白的纯度,符合分子量和肽质量指纹图谱的测定要求。对3种核酸酶进行分子量测定,结果表明EWD1,2,3的精确分子量分别为157191.388,69074.741和63461.35。通过酶解样品得到了EWD1和EWD2核酸酶的肽质量指纹图谱,进行Sequest数据库检索,未能发现与之相匹配的蛋白,提示数据库中没有这两种蛋白的信息,推测这两种核酸酶为新蛋白。将3种核酸酶的一般性质与现今发现的核酸酶进行了比较,EWDs较已发现的DNase I和DnaseП分子量大,种类多。该研究进一步给出了分子量的精确数据,通过肽质量指纹图谱和Sequest检索匹配,证明以往未发现同类结构的核酸酶。三、双胸蚓核酸酶(EWDs)蛋白质一级结构的研究: 1.采用质谱和多糖水解酶类初步分析表明,该3种蛋白均为糖蛋白; 2. SDS-PAGE、2D- SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS和末端分析对EWDs进行亚基和多肽链数量分析,结果表明,EWD1是由两条多肽链组成的二聚体,分子量分别为61907.322和95284.066,EWD2和EWD3分别由一条多肽链组成。3.通过酸水解法对3种双胸蚓核酸酶进行氨基酸组成分析,结果表明,3种核酸酶的氨基酸组成中,天冬氨酸和天冬酰胺之和的含量最高,都达到近10%,疏水氨基酸亮氨酸的含量也较高,半胱氨酸含量较少,提示其稳定性与蛋白质中疏水氨基酸产生的高比例的疏水