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目的:本研究以成年昆明小鼠为研究对象,首先用D-半乳糖制备急性致衰老模型,然后给予运动干预,从细胞凋亡角度来探讨运动对衰老动物大脑皮质神经元的保护作用。方法:1.实验动物的分组:选择40只健康雄性昆明小鼠,清洁饲养。将动物随机分为四组(n=10),对照组(不采用任何方法)、对照运动组(加跑轮运动)、模型组(注射D-半乳糖)、模型运动组(注射D-半乳糖后加跑轮运动)。2.模型制备:D-半乳糖(125mg/kg)颈部皮下注射昆明小鼠,1次/天,连续注射8周,制备急性致衰老小鼠模型,对照组注射相同体积生理盐水。运动组以强度6m/min进行跑轮运动,每天运动30分钟。运动8周,每周休息2天。3.标本制备:每组取5只小鼠,常规灌注固定、取脑、石蜡包埋。行冠状切片,片厚5μm,选取包含背侧海马平面的冠状切片裱于涂有多聚赖氨酸的载玻片上,用做HE染色、TUNEL染色和免疫组化染色。每组取5只小鼠,麻醉后断头取脑。取背侧海马对应的大脑皮质50mg,提取蛋白。测定蛋白浓度后冻存在-80℃低温冰箱内,用做western blot检测。4.实验方法1)用HE染色的方法观察小鼠大脑皮质的形态学变化。2)用TUNEL检测小鼠大脑皮质内凋亡细胞的变化。3)用免疫组化方法观察小鼠大脑皮质内Bcl-2、Bax、Caspase3的表达。4)用Western Blot方法观察小鼠大脑皮质内Bcl-2、Bax、Caspase3的表达。以β-actin作为内参。5.统计学处理:应用SPSS 16.0统计软件对实验数据进行统计学分析,各项检测数据以mean±SEM表示,多组数据比较采用单因素方差分析(ANOVA),用S-N-K检验作组间两两比较。检验水准取α=0.05,当P<0.05时有统计学意义。结果:1.HE染色结果:正常对照组和对照运动组背侧海马平面大脑皮质神经元以正常结构为主,每100个细胞中的变性细胞数,对照组为1.6±1.7,对照运动组为2.3±0.5,二者之间比较无统计学意义(P>0.05)。模型组可见到大量变性细胞,每100个细胞中的变性细胞数为34.5±6.5,与对照组相比差异有显著性意义(P<0.01)。经过运动干预后,模型运动组变性细胞数为23.2±4.0,与模型组相比差异有显著性意义(P<0.01),与对照组相比差异也有显著性意义(P<0.01),提示运动干预可降低衰老模型鼠大脑皮质内变性细胞数量,但是不能恢复到正常水平。2.TUNEL染色结果:观察并计数背侧海马平面大脑皮质内每100个细胞中的凋亡细胞数:对照组为4.8±1.8,对照运动组6.1±0.9,模型组31.4±1.2,模型运动组25.2±2.9。对照组和对照运动组比较,P>0.05无显著性差异;对照组和模型组比较,P<0.01有显著性差异;对照组和模型运动组比较,P<0.01有显著性差异。模型组和模型运动组比较,P<0.01有显著性差异。说明模型组大脑皮质凋亡细胞数量增多,运动后凋亡细胞数量减少,但仍多于对照组。3.背侧海马平面大脑皮质Bcl-2,Bax和Caspase-3免疫组化染色结果:三种蛋白均为胞浆着色。记数每100个细胞中Bcl-2阳性细胞数:对照组为32.6±1.9,对照运动组31.3±3.7,模型组2.4±1.5,模型运动组16.5±1.4。记数每100个细胞中Bax阳性细胞数:对照组为1.5±0.5,对照运动组2.4±1.2,模型组33.1±2.2,模型运动组19.2±1.8。记数每100个细胞中Caspase-3阳性细胞数:对照组为3.8±2.3,对照运动组3.3±1.3,模型组33.3±2.1,模型运动组21.2±2.9。上述三组数据经单因素方差分析,均P<0.01,说明各组之间差别有显著性意义。进一步两两比较,对照组和对照运动组比较,P>0.05无显著性差异;对照组和模型组比较,P<0.01有显著性差异;对照组和模型运动组比较,P<0.01有显著性差异。模型组和模型运动组比较,P<0.01有显著性差异。提示衰老会伴有Bcl-2家族蛋白中最主要的抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低,促凋亡蛋白Bax表达升高;以及执行凋亡的水解蛋白Caspase3表达升高。运动干预可增加衰老模型大脑皮质内Bcl-2表达,降低Bax和Caspase-3的表达,但仍与对照组有差异。4.背侧海马平面大脑皮质Western blot结果:1)Bcl-2蛋白:对照组、对照运动组、模型组、模型运动组的灰度比值分别为1.063±0.201、0.891±0,160、0.531±0.079、0.688±0.065。模型组和模型运动组显著低于对照组(P<0.01),模型运动组显著高于模型组(P<0.01),提示衰老会造成Bcl-2蛋白表达降低,运动可提高衰老模型鼠大脑皮层神经元内Bcl-2蛋白表达,但仍低于对照组。2)Bax蛋白:对照组、对照运动组、模型组、模型运动组的灰度比值分别为0.506±0.747、0.561±0.573、0.898±0.767、0.776±0.092。模型组和模型运动组显著高于对照组(P<0.01),模型运动组显著低于模型组(P<0.01),提示衰老会造成Bax蛋白表达升高,运动可降低衰老模型鼠大脑皮层神经元内Bax蛋白表达,但仍高于对照组。3)Caspase-3蛋白:对照组、对照运动组、模型组、模型运动组的灰度比值分别为0.601±0.211、0.630±0.203、1.044±0.148、0.874±0.113。模型组和模型运动组显著高于对照组(P<0.01),模型运动组显著低于模型组(P<0.05),提示衰老会造成Caspase-3蛋白表达升高,运动可降低衰老模型鼠大脑皮层神经元内Caspase-3蛋白表达,但仍高于对照组。4)Bcl-2/Bax比值变化:Bcl-2/Bax两蛋白之间的比例关系是调控细胞凋亡的关键因素,Bcl-2/Bax比值升高可抑制凋亡的发生。对照组比值为2.12±0.42,对运组为1.62±0.41,均大于1,模型组为0.59±0.08,模型运动组为0.90±0.41,均小于1。模型组和模型运动组显著低于对照组(P<0.01),模型运动组显著高于模型组(P<0.01),提示衰老会造成Bcl-2/Bax比值降低,运动可提高衰老模型鼠大脑皮层神经元内Bcl-2/Bax比值,但仍低于对照组。结论:1.急性致衰老模型小鼠大脑皮质内变性细胞和凋亡细胞数量增多,运动干预可使其降低。2.急性致衰老模型小鼠大脑皮质内Bcl-2表达降低、Bax、Caspase3表达增高,Bcl-2/Bax比值降低;运动干预后Bcl-2表达增高、Bax、Caspase3表达降低,Bcl-2/Bax比值升高,提示运动干预可通过抑制细胞凋亡的实施,从而发挥神经保护作用。