【摘 要】
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目的:补体系统是机体固有免疫中不可缺少的一部分,补体系统的激活有凝集素途径、经典途径和替代途径三种方式,其中凝集素途径是近年来的研究热点。凝集素途径由血浆中甘露聚糖结合凝集素（mannanbinding lectin,MBL）直接识别多种病原微生物表面的N-氨基半乳糖或甘露糖,进而依次活化MASP-1、MASP-2、C4、C2、C3,形成和经典途径相同的C3与C5转化酶,激活补体级联酶促反应的活化
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目的:补体系统是机体固有免疫中不可缺少的一部分,补体系统的激活有凝集素途径、经典途径和替代途径三种方式,其中凝集素途径是近年来的研究热点。凝集素途径由血浆中甘露聚糖结合凝集素（mannanbinding lectin,MBL）直接识别多种病原微生物表面的N-氨基半乳糖或甘露糖,进而依次活化MASP-1、MASP-2、C4、C2、C3,形成和经典途径相同的C3与C5转化酶,激活补体级联酶促反应的活化途径。MBL激活途径的主要激活物为表面含有甘露糖基、岩藻糖和N-氨基半乳糖的病原微生物。进而与甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶（MASPs）结合而启动。至今发现的MASP家族成员有MASP-1、MASP-2和MASP-3丝氨酸蛋白酶及MAp19和MAp44非酶蛋白。其中MAp44蛋白是近年来新发现的MASP蛋白,是属于MASP-1的一种亚型。研究发现其通过与MASP-2竞争结合凝集素来抑制补体系统的激活,此外,MAp44蛋白在心脏发育、心肌缺血再灌注损伤、肝病和糖尿病等多种疾病中发挥着重要的作用。本研究旨在体外构建pCMV3-MAp44-His真核表达载体,表达和纯化MAp44重组蛋白,为后续的深入研究奠定基础。方法:1.将真核表达空载体pCMV3-His进行酶切,使其暴露KpnI和AfeI连接位点。2.利用PCR扩增MAp44目的基因序列。3.将扩增的Map44目的基因片段和真核表达载体pCMV3-His利用连接酶将二者进行连接,以得到pCMV3-MAp44-His质粒,随后将完整质粒送到公司测序验证。4.利用脂质体转染技术将质粒转染到HEK293细胞中。5.收集成功转染的细胞培养上清液,离心后过滤,随后利用His蛋白特异性磁珠将Map44蛋白分离。6.利用SDS-PAGE检测分离的目的蛋白纯度。7.利用免疫印迹法检测Map44蛋白特异性。8.鉴定MAp44蛋白对补体激活的影响。结果:1.扩增出Map44目的基因我们利用PCR技术扩增含酶切臂的MAp44目的基因片段,经1%的琼脂糖凝胶进行电泳,可见长度为2232bp的Map44目的基因片段,大小与预期一致,且无非特异性扩增现象出现。2.pCMV3-MAp44-His表达载体的成功构建及鉴定pCMV3-His表达载体经KpnI、AfeI双酶切后,利用琼脂糖凝胶电泳进行酶切鉴定,鉴定结果与预期一致。随后将扩增好的含酶切臂的Map44基因与酶切后的pCMV3-His表达载体利用连接酶进行连接,得到pCMV3-MAp44-His表达载体。之后进行克隆培养,选取阳性克隆进行测序鉴定,测序结果与NCBI标准序列（NCBI Reference Sequence:NM＿001879.6）一致,无缺失、移码等现象。结果提示,pCMV3-MAp44-His真核表达载体构建成功。3.Map44编码蛋白在HEK293细胞中成功表达将pCMV3-MAp44-His质粒转染至HEK293细胞,转染后第1,3,5天添加M293TI-1培养基,观察转染前后HEK293细胞状态。转染并培养5天后收集培养液上清,使用His蛋白特异性磁珠分离目标蛋白。进行SDS-PAGE电泳,显示得到的Map44蛋白纯度较高,符合要求。随后,利用免疫印迹法鉴定纯化后的Map44蛋白,结果显示,Map44蛋白特异性良好,无非特异性蛋白出现。4.MAp44蛋白对补体激活裂解细菌作用的影响准备不同麦氏浊度的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌悬液,取不同浓度梯度MAp44蛋白分别加入至两种菌悬液中,检测其溶菌作用。结果显示浊度变化并不明显。然后将不同浓度的蛋白菌液接种在血平板（金黄色葡萄球菌）和琼脂平板（大肠杆菌）上,细菌培养箱中37℃培养24 h,并统计每个平板的菌落数,结果显示四个浓度的MAp44蛋白作用后的菌落数无统计学差异。结论:1.成功构建pCMV3-MAp44-His真核表达载体。2.在HEK293细胞中成功获得纯化的MAp44重组蛋白。3.实验未证明Map44蛋白具有对补体激活的抑制作用。
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