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研究背景臭氧(Ozone,O3)是具有鱼腥味的一种强氧化性气体,分为平流层O3和对流层O3。对流层O3是一种常见的大气污染物,主要是由氮氧化物(NOx)和挥发性有机化合物(VOCs)通过光化学反应(photo-chemical reaction)产生。流行病学和实验室研究均发现O3可以引起暴露个体咳嗽、哮喘、肺功能下降等呼吸系统疾病。哮喘(asthma),是一种由多种炎性细胞和细胞因子参与,以气道高反应性(Airway Hyper Reactivity,AHR)和支气管炎症为主要特征的呼吸系统疾病。20世纪以来,世界上200多个国家和地区的哮喘发病率快速上升。儿童哮喘作为一种常见的呼吸系统疾病,其经常性复发会对患儿的健康和成长造成严重危害,甚至会引发成年后的一系列疾病。孕期和生命早期环境空气污染物的暴露可以影响胎儿与新生儿的发育可塑性,且能够改变基因程序或影响表观遗传标记的胎儿发育编程,从而导致永久性的功能结构改变,使子代对环境空气污染物敏感性刺激显著增强,诱导一系列过敏性疾病的发生和发展。大量流行病学调查发现,孕期和生命早期接触环境大气污染物是婴幼儿和儿童哮喘发病的重要原因。尽管研究表明O3暴露可以导致暴露个体一系列呼吸系统疾病,但是很少有研究探索孕期O3暴露对子代哮喘的影响及其机制。因此,本研究旨在探索孕期O3暴露对子代小鼠哮喘可能的影响及其潜在机制。研究目的采用OVA(Ovalbumin,OVA)致敏和激发致哮喘动物模型,以济南市2017年全年大气O3平均浓度为基准,模拟人群O3平均暴露水平进行小鼠孕期O3暴露染毒,探讨孕期低水平O3暴露对子代小鼠哮喘的影响;测定孕期结束和哺乳期结束时母鼠体内可能与子代哮喘发展相关联分子的表达量,从子代和母代两个层面探讨孕期O3暴露对子代小鼠哮喘影响的潜在机制,研究结果将为深层次理解孕期O3暴露对子代哮喘影响的机理提供科学依据。研究方法1.实验设计本研究设计包括两个部分:第一部分是孕鼠O3暴露模型,探讨孕期O3暴露的母体毒性、胚胎毒性以及对子代小鼠哮喘影响的可能机制。根据孕鼠是否O3暴露和观察终点的不同将孕鼠随机分为4个组,两组为O3染毒组,两组为Air对照组。O3染毒组在孕13-18天进行O3暴露染毒(1h/d,6d),随机选取其中一组于妊娠终止结束实验(记为OP组,O3 exposure and ending at the end of pregnancy),另一组于哺乳终止结束实验(记为OL组O3 exposure and ending at the end of lactation);两个对照组分别是妊娠终止对照组(记为AP组,Air exposure and ending at the end of pregnancy)和哺乳终止对照组(记为 AL 组,Air exposure and ending at the end of lactation)。检测孕鼠和哺乳后母鼠相关指标,从母代层面探究孕期O3暴露对子代小鼠哮喘影响的潜在机制。第二部分是子代小鼠哮喘模型,探讨孕期O3暴露对子代小鼠哮喘的影响以及可能机制。将第一部分研究中的OL组和AL组哺乳后的子代小鼠分别随机分为两组,OL组母鼠两组子代小鼠记为O3/PBS组和O3/OVA组,AL组母鼠两组子代小鼠记为Air/PBS组和Air/OVA组,将O3/OVA组和Air/OVA组子代小鼠采用OVA致敏和激发构建子代小鼠哮喘模型。检测四组子代小鼠哮喘发病相关联指标以及脾脏NK细胞的变化,从子代层面探究孕期O3暴露对子代小鼠哮喘的影响及其潜在机制。2.动物分组性成熟BALB/c小鼠购入后在SPF(Specific Pathogen Free,SPF)动物房内适应性喂养一周,雄、雌小鼠按1:2比例合笼。雌鼠受孕日记为受孕第一天(the first day of gestation,GD1)。根据研究设计,在第一部分的母鼠模型中,将实验动物分为四组,即接受O3染毒的OP组和OL组以及相应的AP和AL对照组;在第二部分的子鼠模型中,将第一部分母鼠模型中OL组和AL组孕鼠子代于哺乳结束时各随机分为两组,即孕期O3暴露的OL组子鼠分为O3/OVA组和O3/PBS组;孕期Air对照的AL组的子鼠分为Air/OVA组和Air/PBS组。3.孕鼠暴露处理O3暴露方式:孕鼠通过HOPE-MED 8050G动态染毒仓进行O3暴露;O3暴露浓度:7.3mg/m3;暴露时间:GD13-GD18,1h/d,连续6天。对照组孕鼠在染毒仓内呼吸Air。4.子鼠致敏与激发致敏:子代小鼠在生后(postnatal day,PND)9、11和13天腹腔注射0.1mL致敏液(50μg Grade VOVA和2mg alum adjuvant),对照组注射PBS,注射容量与OVA相同。激发:子代小鼠4周龄时,雾化吸入3%OVA(Grade ⅡOVA),PND22-28,30min/d;对照组雾化吸入PBS,时间与OVA相同。5.观察指标①HEMAVET 950血细胞分析仪对子代小鼠、孕鼠和哺乳后母鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的炎性细胞进行分类检测;②HE和PAS染色观察子代小鼠、孕鼠和哺乳后母鼠支气管周围炎性细胞浸润和黏液分泌;③酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测子代小鼠BALF上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17、TNF-α水平;④ELISA检测孕鼠和哺乳后母鼠血清8-异前列烷(8-isoprostanes,8-IP)水平;⑤免疫组织化学法(Immunohistochemistry,ICH)检查子代小鼠肺脏IL-4表达水平;⑥流式细胞术检测子代小鼠、孕鼠和哺乳后母鼠脾脏CD3ε-CD49b+NK细胞的比重和数目;⑦各观察点孕鼠和哺乳后母鼠的体重以及各脏器的重量;⑧孕鼠的流产率和母鼠产仔只数。6.统计学分析当多组实验数据比较时,若数据符合齐性检验则采用单因素方差分析(one-way ANOVA),当方差分析总体差异有统计学意义时,选用Tukey法进行两两比较;若数据方差不齐,则使用非参数方法(Kruskal-Wallis)进一步分析。当两组实验数据进行比较时,如果方差齐采用两独立样本T检验;当方差不齐应用Fisher’s检验。检验水准:P<0.05差异有统计学意义。7.质量控制①小鼠依据体重随机分到各实验组;②实验过程中O3由同一发生器产生,OVA与Alum采用同一批次;③小鼠染毒以及样本收取均在同一时间段内进行;④实验过程中采用盲法观察和盲法测定。研究结果1.子代小鼠哮喘模型构建结果与Air/PBS对照组相比,Air/OVA组BALF中白细胞总数(White blood cell,Wbc)、嗜酸性粒细胞(Eosinophil,Eos)、淋巴细胞(Lymphocyte,Lym)、嗜中性粒细胞(Neutrophil,Neu)和巨噬细胞(Macrophage,Mac)数目明显增加且差异均具有统计学意义(P值均小于0.05);肺脏支气管周围成圈浸润的炎性细胞数目,肺脏支气管黏液分泌以及血清OVA-specific IgE水平均明显增加且差异均具有统计学意义(P值均小于0.05);与Air/PBS对照组相比,Air/OVA组BALF中IL-4/IFN-γ明显升高且差异具有统计学意义(P<0.05),IL-4/IFN-γ增加48.6%。实验中应用OVA致敏和激发成功构建BALB/c子代小鼠哮喘模型。2.孕期O3暴露对子代小鼠哮喘的影响①BALF中炎性细胞分类计数结果:与Air/OVA对照组相比,O3/OVA组BALF中Wbc、Eos、Lym、Neu和Mac数目均明显增加且差异均具有统计学意义(P<0.001),O3暴露后BALF中Wbc、Eos、Lym、Neu和Mac数目改变的归因危险度百分比AR%分别为43.2%、63.6%、57.2%、71.5%和50.6%。②肺组织炎性细胞的浸润和黏液分泌结果:子代小鼠肺组织病理HE结果表明,与Air/OVA对照组相比,O3/OVA组肺脏支气管周围炎性细胞的浸润明显增加;HE染色的半定量评分结果显示,与Air/OVA对照组相比,O3/OVA组肺脏支气管周围炎性细胞的浸润半定量评分明显升高(P<0.001)。另外,PAS染色结果表明,与Air/OVA组相比,O3/OVA组肺脏支气管杯状细胞(Globet cell,Gc)增生和黏液的分泌均明显增加;PAS半定量评分结果表明,与Air/OVA组相比,O3/OVA组肺脏支气管Gc增生和Gc的area/Pbm半定量评分均明显升高(Gc 增生:P<0.01;Gc 的 area/Pbm:P<0.001)。③BALF中IFN-γ、IL-4、IL-17、TNF-α及肺组织IL-4水平检测结果:Th1的代表性细胞因子IFN-γ检测结果表明,O3/OVA组BALF中IFN-γ水平与Air/OVA组相比无明显差异。Th2的代表性细胞因子IL-4检测结果显示,O3/OVA组BALF中IL-4水平为21.1±4.97pg/ml,较Air/OVA组明显增加,且差异具有统计学意义(P<0.01),O3暴露后BALF中IL-4水平改变的AR%为43.2%;肺脏IL-4免疫组化测定结果表明,与Air/OVA组相比,O3/OVA组肺脏支气管周围IL-4表达水平明显升高;与Air/OVA组相比,O3/OVA组肺脏中支气管周围IL-4染色的平均光密度(Average Optical Density,AOD)明显增加且差异具有统计学意义(P<0.05),O3暴露后肺脏IL-4的AOD改变的AR%为20.4%。IL-4/IFN-γ(Th2/Thl)测定结果显示,与Air/OVA对照组相比,O3/OVA组BALF中IL-4/IFN-γ明显升高且差异具有统计学意义(P<0.01),O3暴露后BALF中IL-4/IFN-γ水平改变的AR%为26.8%。Th17的代表性细胞因子IL-17测定结果显示,O3/OVA 组 BALF中IL-17 水平为 14.6±4.92pg/ml,与 Air/OVA 组相比明显增加且差异具有统计学意义(P<0.01),O3暴露后BALF中IL-17水平改变的AR%为84.3%。促炎因子TNF-α测定结果显示,O3/OVA组BALF中TNF-α水平为35.1+7.06 pg/ml,与Air/OVA组相比明显上升且差异存在统计学意义(P<0.05),O3暴露后BALF中TNF-α水平改变的AR%为23.6%。④血清中OVA-specific IgE水平检测结果:O3/OVA组血清OVA-specific IgE水平为603±125ng/ml,与Air/OVA组相比明显增高且具有统计学意义(P<0.001),O3暴露后血清中OVA-specific IgE水平改变的AR%为55.4%。3.孕期O3暴露对子代小鼠哮喘影响机制的研究结果①子代小鼠层面:子代小鼠脾脏CD3ε-CD49b+NK细胞检测结果显示,与Air/PBS 和 Air/OVA 对照组相比,O3/PBS 和O3/OVA 组脾脏 CD3ε-CD49b+NK细胞比例和数目均明显增加且差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.001),O3暴露脾脏CD3ε-CD49b+NK细胞数目改变的AR%分别20.0%和24.1%。②母代小鼠层面:脾脏CD3ε-CD49b+NK细胞检测结果显示,孕期O3暴露后妊娠期末终止实验的OP组孕鼠脾脏CD3ε-CD49b+NK细胞比例和数目较AP组均明显降低且差异具有统计学意义(P<0.05);孕期O3暴露后哺乳期末终止实验的OL组母鼠脾脏CD3ε-CD49b+NK细胞比例和数目相比于AL组仍明显降低且差异存在统计学意义(P<0.05)。孕期O3暴露损伤了母代小鼠脾脏CD3ε-CD49b+NK 细胞。研究结论1.OVA致敏和激发导致子代小鼠Th2/Th1失衡,表现为Th2优势反应,这可能是OVA致子代小鼠哮喘的可能发病机制。2.孕期O3暴露加重了子代小鼠OVA诱导的哮喘,这可能与子代小鼠CD3ε-CD49b+NK细胞增加直接相关,并且与母体免疫系统损伤间接相关。