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研究目的:肾虚血瘀为骨质疏松症常见病机,补肾益气活血方临床疗效确切。本研究基于Wnt3a/β-catenin信号通路及骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖成骨分化,探讨补肾益气活血方防治绝经后骨质疏松症的作用机制,为“肾藏精”藏象理论及应用提供部分实验依据,对临床防治绝经后骨质疏松症具有一定的理论意义和应用价值。材料与方法:第一部分:理论研究通过梳理古今文献及检索现代临床研究资料,运用理论分析方法,对骨质疏松症相关的中医学病名、病因、病机、辨证、治疗进行归纳和总结,重点对骨质疏松症病机进入深入的探讨和剖析,阐释骨质疏松症的名、因、机、证、治的深刻内涵。第二部分:体内实验研究将90只SPF级SD雌性大鼠随机分为5组:正常组、模型组、补肾益气活血方低剂量组、补肾益气活血方高剂量组、福善美组(阳性药对照组)。除正常组外,其余各组均使用手术摘除双侧卵巢法建立绝经后骨质疏松症大鼠模型。正常组、模型组以生理盐水灌胃,其余各组灌胃相应等容积实验药物。各组均于手术后第2天给药。每日am9:00准时给药,共计12周。最后一次灌胃后,禁食24h,处死动物,取材检测相应指标。应用qRT-PCR和ELISA法检测各组大鼠骨、肾组织Wnt3a、CyclinD1mRNA及蛋白表达。第三部分:体外实验研究实验细胞来源:OriCellTMWistar大鼠骨髓间质干细胞购于赛业(苏州)生物科技有限公司,细胞复苏及培养参照OriCellTMWistar大鼠骨髓间质干细胞说明书步骤规范操作。实验所用药物:补肾益气活血方的有效组分,按功能配伍分为补肾组、益气活血组、补肾益气活血组。实验三的目的是筛选功能配伍各组促进BMSCs增殖与成骨分化的最佳量效。实验分为11组:正常组;成骨诱导组;补肾高剂量组(1);补肾中剂量组(2);补肾低剂量组(3);益气活血高剂量组(4);益气活血中剂量组(5);益气活血低剂量组(6);补肾益气活血高剂量组(7);补肾益气活血中剂量组(8);补肾益气活血低剂量组(9)。分别作用于BMSCs。实验四、五是通过Wnt3a/β-catenin信号通路相关指标观察最佳剂量功能配伍各组对BMSCs增殖与成骨分化的作用机制。Wnt通路抑制剂为DKK1。分为9组:正常组、成骨诱导组、补肾中剂量组(1);益气活血中剂量组(2);补肾益气活血中剂量组(3);成骨诱导+DKK1组(4);补肾中剂量+DKK1组(5);益气活血中剂量+DKK1组(6);补肾益气活血中剂量+DKK1组(7)。实验指标检测:实验三:MTT法检测各组BMSCs24、48、72h增殖情况;ELISA法检测各组细胞12、15d ALP、BGP水平;茜素红染色法观察对15d骨钙结节。实验四:ELISA法检测各组(加入DKK1)15d ALP、BGP水平变化情况;茜素红染色法观察18d骨钙结节;实验五:qRT-PCR法检测各组15dWnt3a、CyclinD1 mRNA表达情况;ELISA法检测各组Wnt3a蛋白表达。实验研究全部采用SPSS17.0统计软件处理实验数据,所有数据以±s表示,体内、体外实验各组数据均用单因素方差分析进行统计分析,P<0.05具有统计学意义。结果:第一部分:理论研究骨质疏松症多归属于中医学的“骨痿”“骨枯”“骨痹”范畴。肾虚髓减,为骨质疏松症发生、发展、变化的基本病机;脾胃虚弱,气血生化乏源;或脾虚及肾,精血互化不及;肝失疏泄,气血失和或运行不畅;或肝肾亏虚,精血不足;久病及肾,多虚多瘀,肾虚血瘀;为骨质疏松症的常见病机;外因多为诱发因素;骨质疏松症性骨折多见气滞血瘀。现代专家共识将骨质疏松症分为肾虚血瘀、肝肾阴虚、气滞血瘀、肾阳亏虚、脾胃虚弱、脾肾阳虚六种证候,以肾虚血瘀证为新增证候,令人关注。临床对于防治肾虚血瘀证骨质疏松症,在补肾方剂中酌情加入益气活血之品,往往可收良效。故本研究补肾益气活血方为基础,开展实验研究,以部分阐明其作用机制。第二部分:体内实验研究1.各组大鼠骨组织Wnt3amRNA表达及蛋白表达变化的情况与正常组比较,模型组骨组织Wnt3a mRNA表达明显降低(P<0.01);与模型组比较,各用药组骨组织中Wnt3a mRNA表达有不同程度上调(P<0.01),以福善美组最明显(P<0.01);福善美组及补肾益气活血高剂量组均可上调骨组织中Wnt3a mRNA表达,两组比较无统计学意义(P>0.05)。与正常组比较,模型组骨组织Wnt3a蛋白表达明显降低(P<0.01);与模型组比较,各用药组骨组织中Wnt3a蛋白表达有不同程度上调(P<0.01),以补肾益气活血方高剂量组最明显(P<0.01);补肾益气活血高剂量组及福善美组均可上调骨组织中Wnt3a蛋白表达,两组比较无统计学意义(P>0.05)。2.各组大鼠骨组织CyclinD1 mRNA表达的变化情况与正常组比较,模型组骨组织CyclinD1 mRNA表达明显降低(P<0.01);与模型组比较,各用药组骨组织中CyclinD1 mRNA表达有不同程度上调(P<0.01),以福善美组最明显(P<0.01);福善美组及补肾益气活血高剂量组均可上调骨组织中CyclinD1mRNA表达,两组比较无统计学意义(P>0.05)。3.各组大鼠肾组织Wnt3amRNA表达及蛋白表达变化的情况与正常组比较,模型组肾组织Wnt3a mRNA表达明显降低(P<0.01);与模型组比较,各用药组肾组织中Wnt3a mRNA表达有不同程度上调(P<0.01),以福善美组最明显(P<0.01);福善美组及补肾益气活血高剂量组均可上调骨组织中Wnt3a mRNA表达,两组比较无统计学意义(P>0.05)。与正常组比较,模型组肾组织Wnt3a蛋白表达明显降低(P<0.01);与模型组比较,其他各用药组肾组织中Wnt3a蛋白表达有不同程度上调(P<0.01),以补肾益气活血方高剂量组最明显(P<0.01);其次为福善美组。4.各组大鼠肾组织CyclinD1 mRNA表达的变化情况与正常组比较,模型组肾组织CyclinD1 mRNA表达明显降低(P<0.01);与模型组比较,其他各用药组肾组织中CyclinD1 mRNA表达有不同程度上调(P<0.01),以福善美组最明显(P<0.01);福善美及补肾益气活血高剂量组均可上调肾组织中CyclinD1 mRNA表达,两组比较无统计学意义(P>0.05)。第三部分:体外实验研究1.24h、48h、72h各组BMSCs增殖情况(实验三)24h:与成骨诱导组比较,补肾高剂量组BMSCs增殖能力提高差异不明显(P>0.05)、补肾中剂量组、补肾益气活血中剂量组BMSCs增殖能力略有升高差异不明显(P>0.05),其他各用药组BMSCs增殖有所降低,但无统计学意义(P>0.05)。48h:与成骨诱导组比较,补肾高剂量组BMSCs增殖能力提高差异不明显(P>0.05)、益气活血中剂量组、补肾益气活血中剂量组BMSCs增殖能力接近,无统计学意义(P>0.05),其他各用药组BMSCs增殖有所降低,但无统计学意义(P>0.05)。72h:与成骨诱导组比较,补肾高剂量组、益气活血低剂量组、补肾益气活血中剂量组BMSCs增殖能力接近,无统计学意义(P>0.05),其他各用药组BMSCs增殖有所降低,但无统计学意义(P>0.05)。2.12d、15d各组细胞ALP水平的变化情况(实验三)12d:与成骨诱导组比较,补肾高、中、低剂量组、益气活血高、中、低剂量组、补肾益气活血低剂量组ALP水平均有下降(P<0.01),而补肾益气活血高、中剂量组ALP水平与成骨诱导组接近(P>0.05)。15d:与成骨诱导组比较,用药各组ALP水平均有下降(P<0.01);其中,补肾中剂量组、益气活血中剂量组、补肾益气活血高、中剂量组ALP水平略高,但无统计学意义(P>0.05)。3.12d、15d各组细胞BGP水平的变化情况(实验三)12d:与成骨诱导组比较,用药各组BGP水平均有下降(P<0.01),其中,补肾中剂量组、补肾益气活血高、中、低剂量组BGP水平略高,但无统计学意义(P>0.05)。15d:与成骨诱导组比较,用药各组BGP水平均有下降(P<0.01);其中,补肾益气活血高、中、低剂量组BGP水平略高,但无统计学意义(P>0.05)。4.15d细胞形态学骨钙结节情况(实验三)从茜素红染色对骨钙结节的细胞形态学观察,以成骨诱导组、补肾中剂量组、补肾益气活血中剂量组最为明显,提示在BMSCs成骨分化过程中对骨钙结节形成有促进作用。5.15d各组细胞(用药组加入DKK1)ALP水平的变化情况(实验四)与正常组比较,成骨诱导组ALP水平明显升高(P<0.01);成骨诱导+DKK1组ALP水平明显上升(P<0.01)。与成骨诱导组比较,益气活血组ALP水平有显著性差异(P<0.01);补肾组、补肾益气活血组略有降低(P<0.01)。与成骨诱导组+DKK1组比较,补肾+DKK1组、益气活血+DKK1组、补肾益气活血+DKK1组ALP水平均有降低(P<0.01),但补肾益气活血组ALP水平比补肾+DKK1组、益气活血+DKK1组明显升高(P<0.01)。6.15d各组细胞(用药组加入DKK1)BGP水平的变化情况(实验四)与正常组比较,成骨诱导组BGP水平明显升高(P<0.01);成骨诱导+DKK1组BGP水平明显上升(P<0.01)。与成骨诱导组比较,补肾组BGP水平无显著性差异(P>0.05);益气活血组、补肾益气活血组略有降低(P>0.05)。与成骨诱导组+DKK1组比较,补肾+DKK1组、益气活血+DKK1组、补肾益气活血+DKK1组BGP水平均有降低(P<0.01),但补肾益气活血+DKK1组BGP水平比补肾+DKK1组、益气活血+DKK1组明显升高(P<0.01)。7.18d(用药组加入DKK1)细胞形态学骨钙结节情况(实验四)从茜素红染色对骨钙结节的细胞形态学观察,以成骨诱导组、补肾中剂量组、补肾益气活血中剂量组最为明显,提示在BMSCs成骨分化过程中对骨钙结节形成有促进作用。8.15d各组细胞(用药组加入DKK1)Wnt3a mRNA及蛋白表达情况(实验五)与正常组比较,成骨诱导组Wnt3a mRNA表达明显上调(P<0.01);成骨诱导+DKK1组Wnt3a mRNA表达明显降低(P<0.01);与成骨诱导组比较,补肾组、益气活血组Wnt3a mRNA表达明显降低(P<0.01),补肾益气活血组有所上调(P<0.01);与成骨诱导+DKK1组比较,补肾益气活血+DKK1组Wnt3a mRNA表达明显上调(P<0.01);补肾+DKK1组明显上调(P<0.01)。与正常组比较,成骨诱导组、成骨诱导+DKK1组Wnt3a蛋白表达明显上调(P<0.01);与成骨诱导组比较,补肾组、益气活血组、补肾益气活血组Wnt3a蛋白表达则有所降低(P<0.01);与成骨诱导+DKK1组比较,补肾益气活血+DKK1组Wnt3a蛋白表达无明显差异(P>0.05),益气活血+DKK1组明显降低(P<0.01)。9.15d各组细胞(用药组加入DKK1)CyclinD1mRNA表达情况(实验五)与正常组比较,成骨诱导组明显上调(P<0.01);与成骨诱导组比较,补肾益气活血组CyclinD1mRNA表达明显上调(P<0.01),补肾组、益气活血组则有所降低(P<0.05);与成骨诱导+DKK1组比较,补肾益气活血+DKK1组CyclinD1mRNA表达明显上调(P<0.01),其次为补肾+DKK1组(P<0.05),益气活血+DKK1组则无明显差异(P>0.05)。结论:1.骨质疏松症属于中医学“骨痿”“骨枯”“骨痹”的范畴,其发病脏腑主要责之肾、肝、脾。肾虚髓减为骨质疏松症的基本病机,贯穿病变始终;脾胃虚弱、肝肾亏虚、脾肾不足、肾虚血瘀等为骨质疏松症的常见病机。故临床治疗多以补肾益髓、补益肝肾、健脾养血、益气活血为主。2.补肾益气活血方可以上调绝经后骨质疏松症模型大鼠骨、肾组织Wnt3a、CyclinD1mRNA表达及Wnt3a蛋白表达,从而起到防治骨质疏松症的作用。3.补肾益气活血方有效组分功能配伍,补肾、益气活血、补肾益气活血方各组均可以促进BMSCs增殖和成骨分化,以补肾益气活血方有效组分效果最为明显,可以升高ALP、BGP水平,促进骨钙结节形成。4.BMSCs成骨分化与Wnt细胞通路上游启动蛋白Wnt3a mRNA及蛋白表达、下游蛋白CyclinD1mRNA表达有关;在Wnt通路抑制剂DKK1作用下,补肾益气活血方有效组分可以对Wnt信号通路的抑制具有激活作用,有效上调Wnt3a/β-catenin信号通路上游启动蛋白Wnt3a的mRNA及蛋白表达、下游相关指标CyclinD1mRNA表达,从而起到防治骨质疏松症的作用。5.补肾益气活血方及其有效组分能够通过调控Wnt3a/β-catenin信号通路,对骨质疏松症发挥防治的作用。