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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus),是一种单股负链环状的DNA病毒。PCV2能引起母猪繁殖障碍、断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道综合征和PCV2相关性肠炎等多种疾病,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。目前,疫苗免疫仍是防控PCV2的主要手段,我国市面上的疫苗主要是灭活疫苗,该类疫苗对PCV2的防控起到了重要作用。但是,目前的灭活疫苗也存在诸如不能有效的诱导宿主产生细胞免疫,其产生的抗体不能同野毒相区别等缺陷。iDNA疫苗作为一种新型基因工程疫苗,其既能发挥核酸疫苗的作用,又能发挥弱毒疫苗的作用,能同时诱导体液免疫和细胞免疫,具有良好的发展前景。鉴于此,本研究通过基因工程技术构建了携带遗传标记的PCV1-2嵌合病毒感染性克隆质粒,拯救获得了携带遗传标记的重组病毒株,并对其进行了初步鉴定,为研发PCV2 iDNA标记疫苗奠定了基础,主要研究内容如下:1、PCV2贵州分离株各基因型之间的差异及生物信息学分析本研究首先对PCV2贵州分离株各基因型之间的差异及生物信息学进行了分析,旨在掌握贵州省PCV2流行毒株的分子遗传特征,为构建携带遗传标记的PCV1-2嵌合病毒亲本毒株基因型的选择和PCV2的防控提供参考。构建进化树显示,当前贵州流行株主要为PCV2b和PCV2d基因型毒株。通过对收集的51株PCV2核苷酸序列的比较分析发现,PCV2各基因型毒株的全基因组大小分别为PCV2a(1768 bp)、PCV2b(1767 bp)、PCV2c(1767bp)、PCV2d(1767 bp)、PCV2e(1768bp),ORF2基因组大小分别为PCV2a(702 bp)、PCV2b(702 bp)、PCV2c(705bp)、PCV2d(705bp)、PCV2e(702 bp),根据他们基因组的差异可以将PCV2a/PCV2e、PCV2b、PCV2c/PCV2d进行区分;各PCV2毒株核苷酸序列之间的差异主要存在于ORF2和ORF1内,同种基因型毒株之间的氨基酸序列较为保守,不同基因型毒株之间的氨基酸序列差异较大,其中PCV2a同PCV2d毒株之间的差异最大,PCV2b型毒株与另外2种基因型毒株之间的差异稍小,推测PCV2b可能是PCV2a向PCV2d演化的一种过渡基因型毒株;从序列相似性来看,PCV2b型毒株是研发PCV2 i DNA疫苗的良好候选疫苗毒株。2、PCV1-2m-V5嵌合病毒感染性克隆质粒的构建及初步鉴定根据序列分析的结果,本研究选择PCV2b型的GZ-RH1株作为亲本毒株,通过设计1对含V5标签的引物,应用PCR技术将V5标签引入到PCV2 ORF2末端后,再用携带V5标签的PCV2 ORF2置换PCV1 ORF2,并将其定向克隆至pcDNA3.1真核表达载体,经系列鉴定证明成功构建了pcDNA3.1-PCV1-2m-V5感染性克隆质粒。将该感染性克隆质粒通过肌肉注射接种至昆明小鼠后,分别于第7d、14d、21d、28d、35d、42d断尾采集小鼠血液,并通过PCR对血液样品进行PCV1-2m-V5病原核酸检测,检测结果显示试验小鼠从第7d开始产生PCV1-2m-V5病毒血症,一直持续到第21d,将第14d检测的阳性PCR产物克隆测序,结果显示,该序列与构建的pcDNA3.1-PCV1-2m-V5感染性克隆质粒序列存在5个氨基酸的差异,其余序列一致,表明通过小鼠接种试验,成功拯救获得了PCV1-2m-V5病毒。而后,分别将含有PCV1-2m-V5病毒的阳性血清和PCV2GZ-RH1病毒接种至PK15细胞,分别以V5标签单克隆抗体和PCV2阳性血清为一抗,对第5代接毒细胞进行IFA检测。以V5标签单克隆抗体为一抗的IFA检测结果显示,在接种PCV1-2m-V5病毒的PK15细胞中检测到了绿色荧光,接种PCV2 GZ-RH1病毒的PK15细胞中无明显荧光;而以PCV2阳性血清为一抗的IFA检测结果显示,接种PCV1-2m-V5和PCV2 GZ-RH1病毒的PK15细胞中均有明显绿色荧光。分别收集接种PCV1-2m-V5和PCV2 GZ-RH1病毒的第5代细胞培养物,以V5标签为一抗进行WesternBlot检测,结果表明接种PCV1-2m-V5病毒的细胞培养物中有特异性目的条带,接种PCV2 GZ-RH1病毒的细胞培养物为阴性,IFA和WesternBlot检测结果表明拯救的PCV1-2m-V5病毒能在感染细胞中产生携带有V5标签的Cap蛋白,利用该特点,可选用血清学方法对拯救病毒与野毒感染进行鉴别。此外,利用携带V5标签的引物分别对接种PCV1-2m-V5和GZ-RH1 PCV2病毒的第5代细胞培养物进行ORF2-V5基因检测,能在接种前者的细胞培养物中检测到特异性条带,而在后者中不能检测到特异性条带,表明可利用该对引物对拯救病毒和野毒进行鉴别。PCV1-2m-V5拯救病毒的电镜形态观察结果显示,在以V5抗体进行的免疫沉淀实验样品中,可见与PCV形态大小一致的病毒粒子,表明第5代细胞培养物中存在携带V5标签的PCV1-2m-V5粒子。本研究成功构建了pcDNA3.1-PCV1-2m-V5感染性克隆质粒,并获得了PCV1-2m-V5拯救病毒株;初步鉴定表明PCV1-2m-V5可在PK15细胞中增殖,利用实验设计的特异性引物可以对PCV1-2m-V5与其他PCV2毒株进行区别,针对拯救病毒既能对V5抗体产生免疫学反应,也能对Cap蛋白抗体产生免疫学反应,提示应用V5蛋白标记的ELISA可对该拯救病与PCV2野毒抗体进行区别,该研究为PCV2 iDNA标记疫苗的研制奠定了基础。