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肝脏缺血再灌注（Ischemia/reperfusion,I/R）损伤是临床常见的一种病理现象,不仅严重影响外科手术的进程,而且对患者预后也极其不利。当前临床上肝脏I/R的治疗方法主要集中于物理方法、药物预处理以及损伤后药物治疗等手段,这些治疗方法虽然能起到一定的作用,但都存在一定缺陷,因此如何为肝脏I/R患者提供一种安全有效的保护及治疗方式是目前研究的热点。因此大量的研究发现,脂肪干细胞来源的外泌体（ADSCs-EXO）可在多种组织器官的修复中发挥有效作用,但目前关于同种异体来源的ADSCs-EXO在肝I/R中的作用尚不清楚。本研究利用大鼠肝脏I/R损伤模型,研究ADSCs-EXO对大鼠肝I/R的保护作用,并初步对其作用机制进行研究,为I/R的治疗提供一种新的有效的方案。第一部分:大鼠脂肪干细胞来源的外泌体的分离与鉴定【目的】首先通过胶原蛋白酶消化法提取大鼠脂肪干细胞进行培养与鉴定,其次提取并鉴定脂肪干细胞外泌体,为下一步实验奠定基础。【材料与方法】手术切取大鼠脂肪组织（腹股沟）,使用I型胶原蛋白酶消化获取的脂肪,按照提取步骤进行脂肪干细胞的提取,培养稳定以后,鉴定细胞表面的特异性标记物,并通过成脂、成骨、成软骨诱导分化实验鉴定其分化能力。收集稳定培养传代的ADSCs培养上清液进行外泌体的提取,然后对外泌体进行电镜观察、粒径分析及表面特异性标志物的Western Blotting测定,完成ADSCs-EXO鉴定。【结果】1、细胞形态观察显示,培养细胞4-5 d以后,细胞的生长密度很高,以旋涡状或者放射状进行排列;培养细胞7d以后,表现出典型的鱼群状的生长外观,表明提取分离的细胞为ADSCs。2、ADSCs流式细胞仪的检测结果表明,CD90、CD44、CD73等阳性标记物显示为阳性,而CD45、CD11b、CD34等阴性标记物显示为阴性,证明提取获得的是ADSCs。3、本实验获取的ADSCs可被成功诱导分化为脂肪、成骨和软骨细胞。4、电子显微镜显示,ADSCs-EXO为椭圆形或圆形小囊状的典型形态,为双层脂质膜,直径范围为50-100nm。5、粒径分析结果显示,ADSCs-EXO体积比重中位数为164.5;ADSCs-EXO直径分布中位数为125.6 nm;颗粒浓度的实际测量值为2.4×10~7个/m L。6、Western Blotting结果显示,ADSCs-EXO能够表达CD9、CD63以及TSG101。【结论】本实验能够成功分离获得ADSCs-EXO,所得的外泌体符合相关鉴定标准,可用于下一步实验研究。第二部分:脂肪干细胞外泌体预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护作用的研究【目的】采用无损伤血管夹可逆性阻断肝左中叶血管建立70%大鼠肝脏热缺血再灌注模型,通过血清酶检测、组织病理分析以及免疫印迹相关信号通路来研究ADSCs-EXO预处理对肝缺血再灌注的保护效应及其机制。【材料与方法】将大鼠随机分为假手术组（SHAM组）、PBS+I/R组、ADSCs-EXO+I/R组,其中SHAM组只开腹不夹闭血管、PBS+I/R组夹闭血管前经门静脉注入50μl PBS、ADSCs-EXO+I/R组夹闭血管前前经门静脉注入50μl ADSCs-EXO悬液。于肝脏再灌注2h、6h、12h和24h收集各组大鼠血液和肝脏组织,然后分别进行以下实验内容:1、测定血清中ALT、AST、LDH、c AMP、TNF-a和IL-1?;2、检测肝脏中MDA、SOD、ROS;3、肝脏组织制备切片做H-E、Tunel和免疫组化染色;4、测定Bcl-2、Bax、ERK1/2、p-ERK1/2、GSK3?和p-GSK3?等相关信号蛋白的表达情况。【结果】1、SHAM组、PBS+I/R组、ADSCs-EXO+I/R组血清酶学检测结果显示:再灌注2h、6h和12h,PBS+I/R组血清中的ALT、AST、LDH、IL-1?和TNF-a含量明显升高,而ADSCs-EXO预处理后可明显使I/R后血清中的ALT、AST和LDH含量低于PBS+I/R组（P<0.05）,且ADSCs-EXO+I/R组的IL-1?和TNF-a水平也比PBS+I/R组明显更低（P<0.05）。2、各组再灌注6h和24h肝脏组织病理学结果显示:PBS+I/R组出现明显的肝损伤,ADSCs-EXO+I/R组肝坏死程度明显减轻（H-E染色）,肝细胞凋亡数明显减少（TUNEL染色）,肝细胞线粒体等细胞器形态明显改善（透射电镜下细胞超微结构）。3、SHAM组、PBS+I/R组、ADSCs-EXO+I/R组与肝脏氧化应激相关指标显示:在肝组织中,PBS+I/R组的MDA和ROS含量比SHAM组明显增加（P<0.05）,而SOD水平明显减少（P<0.05）;与PBS+I/R组相比,ADSCs-EXO+I/R组肝组织MDA和ROS水平明显更低（P<0.05）,但SOD水平明显升高（P<0.05）。4、血清ELISA检测再灌注2h和6h c AMP水平显示:ADSCs-EXO+I/R组比PBS+I/R组c AMP水平明显升高（P<0.05）。5、蛋白信号通路测定结果显示:再灌注2h和6h时,与PBS+I/R组相比较,ADSCs-EXO+I/R组p-ERK1/2和p-GSK3?表达明显增加（P<0.05）。【结论】ADSCs-EXO对肝I/R具有保护和修复作用,其机制可能是增加ERK1/2和GSK3?的磷酸化水平,以此减少肝细胞凋亡和坏死来预防I/R损伤。将ADSCs-EXO用于预防肝I/R,具有良好的临床转化和应用前景,为I/R的预防与治疗提供了一种新的有效的方案和思路。