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研究背景宫颈癌(Cervical cancer,CC)在世界各地癌症相关死亡的原因中排名第四位,它是全世界妇女癌症相关死亡的主要原因之一。尽管宫颈癌的治疗方案包括放疗、化疗和手术等已取得了很大的进展,但由于复发和转移,宫颈癌患者的5年生存率仍然不高。因此,需要开发新的诊断和治疗策略,以期减少复发,提高生存率。黑色素瘤相关抗原A3(Melanoma-associated antigen A3,MAGE-A3)基因是一种癌症睾丸抗原(Cancer-testis Antigen,CTA)基因,其表达在多种恶性肿瘤中得到证实,包括黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肺癌和胰腺癌等。近年来研究表明,MAGE-A3在许多肿瘤类型中的异常表达与不良的临床结局相关。但有关MAGE-A3在宫颈癌中的作用研究较少。为了研究MAGE-A3与宫颈癌的关系,本课题组前期研究通过实时荧光定量PCR、蛋白印迹法和免疫组化的方法,检测了MAGE-A3在正常宫颈组织与宫颈癌组织的表达差异,结果表明,MAGE-A3在宫颈癌组织中的表达明显高于正常组,且其表达水平与宫颈癌的临床分期,病理分级,淋巴转移呈正相关趋势。进一步在宫颈癌细胞系及永生化正常宫颈细胞株(End1/E6E7)中检测MAGE-A3的表达,结果表明,与永生化宫颈细胞株相比,MAGE-A3的m RNA的蛋白水平在宫颈癌细胞株明显增高。基于上述研究的结果,本研究重点探讨MAGE-A3对宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响及其可能的作用机制,以期为宫颈癌的诊断治疗提供新的理论和研究依据。第一章MAGE-A3基因过表达及沉默的宫颈癌细胞株的构建与鉴定目的:检测宫颈癌细胞系中MAGE-A3的表达,构建过表达和沉默MAGE-A3宫颈癌细胞株,为探讨MAGE-A3在宫颈癌中的作用提供基础。方法:1.选取宫颈癌细胞株(Hela、Siha、C33A、Caski)作为研究对象,应用实时荧光定量PCR(Real time Quantitative PCR,q RT-PCR)和蛋白印迹法(Western blot,WB)检2.测宫颈癌细胞株中MAGE-A3的m RNA和蛋白表达量。3.构建MAGE-A3过表达宫颈癌细胞株:应用稳定转染的方法,通过MAGE-A3过表达慢病毒(Lv-MAGEA3)转染宫颈癌细胞,采用q RT-PCR和Western blot检测转染效率。4.构建沉默MAGE-A3宫颈癌细胞株:应用瞬时转染的方法,通过lipofectamine3000将特异性靶向MAGE-A3的si RNA(si-MAGEA3)转染宫颈癌细胞,通过q RT-PCR和Western blot检测转染效率,筛选出有效的si RNA干扰链。结果:1.在四种宫颈癌细胞系Hela、Siha、C33A、Caski中,qRT-PCR及WB检测结果均显示MAGE-A3在Hela中表达相对较高,在Siha中表达相对较低。2.选择Siha细胞作为过表达MAGEA3的研究对象,将空载慢病毒阴性对照(Lv-NC)及过表达慢病毒(Lv-MAGEA3)分别转染Siha细胞,q RT-PCR及WB检测显示与Lv-NC组相比,Lv-MAGEA3组明显上调细胞中MAGE-A3的表达(P<0.01)。3.选择Hela细胞作为沉默MAGE-A3的研究对象,将阴性对照si RNA(si RNA-NC)和MAGE-A3特异性si RNA(si MAGEA3-1、si MAGEA3-2、si MAGEA3-3)分别转染Hela细胞,q RT-PCR及WB检测显示与空白对照组(Hela-Blank)相比,si RNA-NC组MAGE-A3的表达无明显差异,而si MAGEA3-1、si MAGEA3-2、si MAGEA3-3组均可降低细胞中MAGE-A3的表达,干扰效率分别为(88.31±1.28)%、(77.64±4.33)%和(16.27±3.41)%,其中si MAGEA3-1和si MAGEA3-2沉默MAGE-A3的效率最明显(P值均<0.01)。后续试验选用si MAGEA3-1和si MAGEA3-2作为干扰链。结论:MAGE-A3在Hela细胞中表达相对较高,在Siha细胞在表达相对较低;分别应用MAGE-A3过表达慢病毒和MAGE-A3特异性si RNA,可成功构建MAGE-A3过表达和沉默宫颈癌细胞株。第二章MAGE-A3对宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响目的:观察MAGE-A3对宫颈癌细胞增殖、细胞周期及凋亡生物学行为的影响。方法:1.通过CCK-8、Ed U细胞增殖实验,分析过表达或沉默MAGE-A3对宫颈癌细胞增殖的影响。2.通过流式细胞周期及凋亡实验,分析过表达或沉默MAGE-A3对宫颈癌细胞周期及凋亡的影响。结果:1.CCK-8和EdU实验结果显示,过表达MAGE-A3促进宫颈癌细胞的增殖能力,而沉默MAGE-A3抑制宫颈癌细胞的增殖能力。2.流式细胞周期及凋亡实验结果显示,过表达MAGE-A3促进宫颈癌细胞细胞周期进展(S期细胞比例增加),抑制细胞凋亡(细胞凋亡率降低)(P值均<0.05);沉默MAGE-A3使细胞周期阻滞在G1期(G1期细胞比例增加,S期减低),诱导细胞凋亡(细胞凋亡率升高)(P值均<0.05)。结论:MAGE-A3促进宫颈癌细胞增殖及细胞周期进展,抑制凋亡,提示MAGE-A3在宫颈癌的发生和发展过程中发挥了促癌的作用。第三章MAGE-A3与KAP1/P53信号通路在宫颈癌中的作用关系目的:观察宫颈癌中MAGE-A3对KAP1/P53信号通路的影响,探讨MAGE-A3在宫颈癌中发挥促癌作用的可能机制。方法:1.在宫颈癌细胞中过表达或沉默MAGE-A3基因后,采用qRT-PCR和WB检测KAP1、p53 m RNA和蛋白表达变化.2.WB检测p53通路下游基因中参与细胞周期(P21,CyclinD1)和凋亡(Bax,Bcl-2)的蛋白表达情况。3.在过表达MAGE-A3的细胞培养基中加入Nutlin3(p53激动剂)继续培养48 h,通过流式细胞周期及凋亡实验,分析宫颈癌细胞周期及凋亡的变化;WB检测p53及p53通路下游基因p21、bax的蛋白表达变化情况。结果:1.qRT-PCR和WB检测结果显示,在Siha细胞中过表达MAGE-A3后,KAP1表达上调,p53表达下调;而在Hela细胞中沉默MAGE-A3后,KAP1表达下调,p53表达上调。2.WB检测结果显示,Siha-Lv-MAGEA3组的p53通路下游蛋白P21和Bax表达下调,Cyclin D1和Bcl-2表达上调,凋亡蛋白Cleaved-caspase3表达减低(P值均<0.05);而Hela-si MAGEA3-1和si MAGEA3-2组的检测结果与上述相反,差异有统计学意义(P值均<0.05)。3.流式细胞周期及凋亡实验及WB实验显示:Lv-MAGEA3组与对照组Lv-NC组相比,细胞周期S期增加,凋亡率下降;p53、p21、Bax蛋白表达下调(P值均<0.05)。然而,加入Nutlin3后,细胞周期S期降低,G1期上升,凋亡率升高;p53、p21、Bax蛋白表达较Lv-MAGEA3组上调(P值均<0.05)。结论:MAGE-A3通过KAP1/p53信号通路促进宫颈癌细胞增殖,抑制细胞凋亡。