马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)以其出色的耐高温产酒精特性,及广泛的底物适应性,被认为是酒精生产中的理想菌株。本实验室经过努力筛选出一株高产酒精的耐高温马克思克鲁维酵母,其在40℃时仍然有很高的产酒率。在其耐高温产酒精的机理方面,本室已做了初步研究,包括对酵母中热激蛋白,海藻糖及细胞膜脂肪酸的饱和程度等方面做了较全面分析。然而乙醇脱氢酶作为乙醇代谢中的重要酶,其生化特性与酵母高温下产酒精有何关系至今还没有报道,本课题将对马克思克鲁维酵母乙醇脱氢酶系的4个同工酶进行异源克隆表达,并试图对4个酶的生化特性进行研究及分析比对,以期从该酶的角度分析酵母耐高温产酒精的机理。本室前期已经成功对马克思克鲁维酵母ADH1和ADH2基因进行了异源表达,本实验主要是针对ADH4基因进行研究。通过PCR扩增出K.marxianus GX-15的ADH4基因,并与pET-32a(+)质粒构建成pET32-ADH4重组表达质粒,将其导入E.coli Rosseta(DE3)表达宿主,在20℃条件下,经过16h的诱导表达,将菌体进行超声波破胞,经过离心后,对上清液中的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测,重组蛋白的大小约为60 kDa,与预测结果一致,经过Ni柱亲和层析纯化蛋白后,对其进行酶学性质的研究,结果表明,该重组蛋白乙醇脱氢酶的活性最适温度为50℃,最适pH为7.0,最适底物为乙醇,并在乙醇为底物时,其Km值为204.5 mM,最大反应速度为62.5 μmolmin-1mg-1,该重组蛋白对乙醛没有催化活性,即不催化乙醇到乙醛的逆反应。