论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是近些年危害养猪业最严重的传染病之一,免疫接种仍然是主要的防制措施。然而如何获得高滴度猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),成为制约PRRS疫苗免疫效果的瓶颈。研究表明,人为干扰细胞凋亡,有可能促使病毒在细胞内的大量增殖,进而提高病毒的滴度。因此,本研究进行广西PRRSV流行株的分离鉴定,并以其为研究对象探讨了 caspase抑制剂提高PRRSV分离株体外培养滴度的可行性。具体研究结果如下:1.PRRSV广西流行株的分离鉴定。2013年,从广西玉林某发病猪场采集的疑似PRRS的肺组织病料中分离到一株PRRSV,接种Marc-145细胞后,48h开始出现PRRSV典型细胞病变。采用RT-PCR的方法,从细胞培养物扩增出包含ORF7和Nsp2全基因的序列,经克隆测序分析,结果发现该分离株ORF7基因全长为372bp,编码124个氨基酸;Nsp2基因全长为2 850 bp,编码950个氨基酸,其中Nsp2基因在第481位、532～560位发生了共30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV JXA1株Nsp2基因缺失特征一致,同源性分析发现,分离株与JXA1株的核苷酸与氨基酸同源性分别为98.9%、97.9%,表明该分离株属于美洲型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(命名为13GXYL-1)。电镜观察发现13GXYL-1毒株,可见直径约50～70nm,呈球形,有囊膜的病毒粒子。2.Caspase抑制剂作用于PRRSV感染细胞提高体外培养病毒滴度的初步研究。以13GXYL-1第五代细胞培养物为种毒,接种Marc-145细胞,测定病毒TCID50,筛选最佳的caspase抑制剂及其最佳的作用浓度和时间。结果发现,以15μM的caspase-8、9、3抑制剂处理PRRSV感染细胞,caspase-8处理组病毒TCID50明显高于caspase-9、3组及对照组(107.25/0.1mLvs104.0/O.1mL,103.25/0.1mL,105.75/0.1mL);当用不同浓度(5,10,20,40μM)的caspase-8处理病毒感染细胞时,10μM处理组病毒TCID50要明显高于其他处理组(5,20,40μM)及对照组(106.25/0.1mL vs 103.75/0.1mL,104.25/0.1mL,104.25/0.1mL,105.25/0.1mL);当细胞接种病毒后不同时间段(0,24,48,60h)添加10μM caspase-8抑制剂时,48h添加组的病毒TCID50要明显高于其他添加组(0,24,60h)及对照组(1010.16/0.1mL vs 104.2/0.1mL,104.8/0.1mL,104.25/0.1mL,105/0.1mL)。以 caspase-8 活性检测试剂盒、流式细胞术及相对荧光定量PCR分析抑制剂在最佳的作用条件下,对caspase活性变化、细胞凋亡及caspase下游蛋白表达量的影响。结果显示,细胞接毒48h后,在一定时间范围内caspase活性随着接种时间的增加而增加,对应的细胞凋亡数也随之增加,其相关凋亡基因BAX(Bcl-2家族促凋亡蛋白)mRNA表达量相应增高,而ICAD(caspase依赖的脱氧核糖核酸酶抑制物)mRNA表达量则降低;而加入抑制剂后,随着时间的增加,与对照相比细胞凋亡数减少,BAX的mRNA表达量降低,而ICAD的mRNA表达量升高,说明 caspase-8特异性抑制剂可以抑制PRRSV引起的Marc-145细胞凋亡。综上所述,本研究成功分离到广西PRRSV流行株,并筛选出能够阻断PRRSV引起的细胞凋亡的caspase特异性抑制剂Z-IETD-FMK(caspase-8特异性抑制剂)。同时初步筛选出其最佳使用浓度与作用时间,在此条件下培养PRRSV-13GXYL-1毒株,可使病毒滴度提高105.16倍,达到提高PRRSV体外培养滴度的目的。