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研究目的当前,糖尿病足溃疡(Diabetic Foot Ulcer,DFU)的治疗方案单一,以局部清创、药物涂抹为主,疗效欠佳。基于创面愈合的研究很多,但是尚无通过系统给药显著性促进创面愈合的药物。为了探究普乐沙福/释倍灵(AMD3100,Plerixafor,Mozobil)联合低剂量他克莫司/普乐可复(FK506,Tacrolimus,Prograf)治疗方案(简写AF治疗方案)是否可以促进糖尿病大鼠皮肤伤口愈合,以及愈合过程中AF治疗方案是如何发挥促进愈合的作用及其潜在的分子机制,本项目从验证药物有效性着手,通过寻找相关分子通路,希望为临床应用自体骨髓干细胞医治DFU提供一个可行的方案。研究方法本实验利用链脲佐菌素(STZ)诱导1型糖尿病(Type 1 Diabetes Mellitus,T1DM)大鼠模型;同时使用Goto-Kakizaki(GK)大鼠复制2型非肥胖自发糖尿病模型。在确定其已合并周围神经和外周血管病变的重症糖尿病并发症后给予AF药物治疗,分别测试药物在这两种模型中对糖尿病创面愈合的修复作用。利用新合成的FK506类似物FKVP来探究BMP通路在AF治疗方案中影响愈合的机制。1.SD大鼠腹腔注射STZ诱导T1DM大鼠模型,制作后背和足伤口模型,观察愈合时间、计算瘢痕大小及评估愈合质量。2.利用GK大鼠的自发2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)的特点,制作后背伤口模型,观察愈合时间,计算瘢痕大小及评估愈合质量。3.收集早期创面组织,分析肉芽组织中干细胞和新生血管的变化。4.分离给药前后外周血中骨髓来源细胞,评估细胞数量,判断干细胞或祖细胞的动员情况。5.观察治疗组和对照组肉芽组织内Ym1~+/Ym2~+M2巨噬细胞的数量、蛋白的表达,推测伤口处募集干细胞的机制。6.检测肉芽组织内影响愈合的细胞因子VEGFA和HGFα的表达情况。7.将GFP~+大鼠骨髓移植给非GFP~+大鼠并诱导T1DM,判断早期肉芽组织内CD133~+干细胞的来源。8.长期治疗后,观察GK大鼠后肢温度和末梢血管病变程度,判断AF治疗方案对改善糖尿病微循环的作用。9.利用合成新化合物FKVP探究BMP通路在AF治疗方案中对愈合影响的机制。研究结果1.T1DM SD大鼠模型的背部皮肤伤口愈合时间由原来的27d缩短到了19d,DFU愈合时间由25d缩短到了20d。2.T2DM GK大鼠模型的背部皮肤伤口愈合时间由原来的26d缩短到了21d。AF方案不仅加速了创面愈合,而且缩小了瘢痕面积并促进了毛囊的再生。3.早期肉芽组织中,AF募集了更多的CD133~+,CD34~+和SDF-1α~+细胞,促进了RECA-1~+新生血管和αSMA~+新生血管的生成。4.AF治疗方案动员骨髓来源CD133~+CD31~+和CD34+干细胞或内皮祖细胞释放入血。5.AF治疗组早期肉芽组织中的Ym1~+/Ym2~+M2巨噬细胞显著增加。其中一部分细胞同时表达SDF-1α。6.AF治疗组早期肉芽组织中细胞因子VEGFA和HGFα的表达显著增加。7.AF治疗组骨髓移植-糖尿病-伤口模型早期肉芽组织中可见大量骨髓来源GFP+细胞与CD133~+细胞共定位。8.AF治疗组的T2DM GK大鼠后肢温度显著高于对照组;过碘酸雪夫染色结果显示治疗组微血管病变程度没有对照组严重。9.FK506或者它的无免疫抑制作用的类似物FKVP通过FKBP12,活化BMPR1激酶,胞内激活BMP通路,促进了伤口愈合。研究结论1.在T1DM SD大鼠模型中,切除全层皮肤后皮肤愈合时间显著延长,AF治疗组使愈合时间缩短,基本等同于非糖尿病大鼠自然愈合的时间。2.即使T2DM GK大鼠患有严重外周神经和血管病变,AF治疗方案也可以加速伤口愈合。3.AF方案可以动员单核细胞和CD34~+、CD133~+CD31~+的干细胞进入血液循环,增加肉芽组织中Ym1/Ym2~+M2巨噬细胞、CD133~+和CD34~+干细胞表达SDF-1α。4.肉芽组织中VEGF-A和HGFα表达增强,AF治疗方案促进了新生血管的生成。5.骨髓移植联合糖尿病伤口模型证实了应用AF后,骨髓来源干细胞促进糖尿病伤口愈合的重要作用。6.AF治疗方案减轻了大鼠后肢糖尿病血管病变;提高了足部皮肤温度并改善了末梢循环。7.BMP通过内源性激活通路与AF促进糖尿病伤口愈合关系密切;该研究为临床治疗DFU提供了一个可能的治疗方案。