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目的： 利用结核分枝杆菌全基因组芯片技术及生物信息学软件，预测并筛选结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，Mtb）HLA-A*0201限制性CTL表位，并通过实验验证表位肽的免疫原性，最终筛选出针对潜伏感染的标准株H37Rv结核分枝杆菌和北京基因型结核分枝杆菌的HLA-A*0201限制性CTL抗原表位。 方法： 1.以标准株H37Rv和北京基因型结核分枝杆菌为研究对象，利用结核分枝杆菌全基因组芯片技术筛选缺氧培养后表达上调的基因，应用SYFPEITHI和NetCTLpan生物信息学软件进一步分析相关基因编码蛋白质氨基酸序列中可能存在的HLA-A*0201限制性CTL表位。 2.人工合成并纯化预测筛选出的表位肽，利用T2细胞进行表位肽与HLA-A*0201分子的结合力分析。 3.将与T2细胞具有较高结合力的表位肽与其他已知抗原肽进行表位优化组合，并引入“木马肽”序列，采用furi肽酶识别基序RVKR作为接头，人工合成复合表位肽Rv0351-M和Rv0350-N，并利用在线的生物信息学软件ExPASy分析复合表位肽的分子量、等电点和亲水性等情况。 4.通过对候选表位肽与HLA-A*0201分子的结合能力、免疫原性、诱导特异性细胞毒作用等方面进行实验验证，观察其能否真正诱导出特异性的抗潜伏感染结核分枝杆菌的细胞免疫应答。(1)对PPD强阳性的健康志愿者进行HLA-A*0201位点分型;(2)密度梯度离心法分离PPD强阳性的健康志愿者外周血获得单个核细胞(PBMC)，体外联合细胞因子GM-CSF、IL-4以及LPS诱导DC成熟分化;(3)外周血单个核细胞分别与各复合表位肽及阳性对照BCG共孵育，ELISPOT技术测定分泌IFN-γ的PBMC;(4)分别负载复合表位肽及阳性对照BCG的成熟DC与外周血单个核细胞共培养刺激诱导特异性CTL，LDH释放试验观察CTL对复合表位肽负载的T2细胞的特异性杀伤效应。 结果： 1.利用基因芯片技术分析后得出，结核分枝杆菌标准株H37Rv及北京基因型结核分枝杆菌在缺氧培养后有130个基因均表达上调，其中有37个基因所编码的蛋白质属于膜蛋白、细胞壁蛋白或分泌性蛋白，选择其中的4个基因作为进一步筛选的对象。利用生物信息学软件SYFPEITHI和NetCTLpan预测并筛选出6条候选的潜伏感染结核分枝杆菌HLA-A*0201限制性CTL表位肽，分别为Rv0351-A(ALVGVVDTV),Rv0350-B(SLLEIGEGV),Rv0440-C(TLLQAAPTL),Rv0440-D(KLAGGVAVI),Rv0351-E(KLDSALTGL)和Rv0350-H(VLLLDVTPL)。 2.通过HLA-A2的亲和性实验发现，Rv0351-A，Rv0440-C，Rv0440-D，Rv0351-E和Rv0350-H与HLA-A*02分子之间均有较高的亲和性(FI＞1)，通过HLA-A2解离实验证实，候选表位肽Rv0440-C，Rv0440-D，Rv0351-E和Rv0350-H与HLA-A*02分子的结合具有较高的稳定性(DC50＞4h)。 3.选择与T2细胞HLA-A*02具有较高亲和性和稳定性的Rv0351-E(KLDSALTGL)和Rv0350-H(VLLLDVTPL)与已知抗原表位肽优化组合，并引入“木马肽”序列，采用识别基序RVKR作为接头合成复合表位肽Rv0351-M(KLDSALTGLRVKRAKFVAAWTLKAAARVKRRKKRRQRRR)Rv0350-N(VLLLDVTPLRVKRAKFVAAWTLKAAARVKRRKKRRQRRR)。通过生物信息学的网络数据库对其进行分析，Rv0351-M和Rv0350-N的分子量均较大(4647.6/4712.8)，等电点均为12.61，且均具有较好的亲水性。 4.ELISPOT实验结果显示，复合表位肽Rv0351-M和Rv0350-N在HLA-A*0201(+)PPD强阳性健康志愿者中能够诱导PBMC显著分泌IFN-γ(P＜0.001);Rv0351-M和Rv0350-N负载DC诱导的CTL在效靶比为10∶1时对负载表位肽T2细胞的杀伤作用显著高于阴性对照组(P＜0.05)。 结论： 1.可将基因芯片技术和生物信息学技术联合应用于结核分枝杆菌表位肽的筛选与预测。 2.复合表位肽Rv0351-M和Rv0350-N可以刺激HLA-A*0201(+)PPD强阳性个体的PBMC分泌IFN-γ;且Rv0351-M和Rv0350-N均能显著诱导CTL对靶细胞的特异性杀伤作用，提示Rv0351-M和Rv0350-N是有效的潜伏感染结核分枝杆菌的HLA-A*0201限制性的CTL表位。